林曉娥 吳景華 王寧 張勇 諶曉楠 祝朝前

唐山市工人醫(yī)院1檢驗(yàn)科，3肝膽外科（河北唐山063000）；2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（河北唐山063000）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，具有較強(qiáng)的復(fù)制能力和感染能力，屬于全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。感染HBV后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，可有效抑制HBV病毒的復(fù)制并清除病毒顆粒［1］。在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)過(guò)程中，CD8+T細(xì)胞扮演重要角色［2-3］。但是，在慢性HBV感染過(guò)程中卻普遍存在T細(xì)胞功能缺陷的現(xiàn)象，致使最終出現(xiàn)肝硬化、肝功能衰竭、原發(fā)性肝癌等更為嚴(yán)重的肝臟疾?。?-5］。有研究［6］顯示，在慢性HBV感染過(guò)程中T細(xì)胞功能缺陷主要由CD8+T細(xì)胞耗竭所致，而CD8+T細(xì)胞耗竭與其活化狀態(tài)密切相關(guān)。Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（magnesium transporter protein 1，MagT1）是Mg2+選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)體，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自由Mg2+濃度，并介導(dǎo)Mg2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。研究證實(shí)，免疫細(xì)胞內(nèi)Mg2+水平對(duì)維持NK和CD8+T細(xì)胞活化至關(guān)重要［7-8］。因此，在慢性HBV感染過(guò)程中MagT1表達(dá)異常有可能是導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞耗竭的重要原因之一，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本研究擬通過(guò)檢測(cè)慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞中MagT1表達(dá)水平，分析其表達(dá)與CD8+T細(xì)胞耗竭的關(guān)系，旨為臨床治療慢性乙型肝炎提供新的理論依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2016年6月至2018年1月本院肝病門診就診的未經(jīng)抗病毒治療的HBV感染者86例作為研究對(duì)象，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》中乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，且患者無(wú)其他特殊病史，并排除其它類型肝炎病毒感染。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室外周血HBV DNA檢測(cè)結(jié)果，將HBV感染者分為高病毒載量組與低病毒載量組［10］。高病毒載量組共45例，其中男27例，女18例，年齡16～65歲，平均（43.15±11.35）歲，HBV DNA載量≥1.0×105copies/mL，血清HBsAg、HBeAg陽(yáng)性，HBeAb陰性；低病毒載量組共41例，其中男24例，女17例，年齡15～63歲，平均（41.54±13.35）歲，HBV DNA載量＜1.0×105copies/mL，血清 HBsAg、HBeAg陽(yáng)性，HBeAb陰性。同時(shí)，另選取20例健康體檢者作為健康對(duì)照組，其中男12例，女8例，年齡16～60歲，平均（40.37±15.11）歲。本研究獲得本院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。3組研究對(duì)象年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2儀器與試劑CD8+T細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自Stemcell Technologies公司；兔抗人CD3單克隆抗體、兔抗人CD28單克隆抗體、兔抗人MagT1多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；FITC-anti-human CD279（PD-1）、APCAnti-human CD314（NKG2D）、PE/CF594-Anti-Human Tim-3、FITC-Anti-Human CD38均購(gòu)自美國(guó)BD公司；Mag-Fura2-AM熒光探針購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit及SYBR?Green PCR Kit購(gòu)自日本TaKaRa公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3方法

1.3.1血樣采集及CD8+T細(xì)胞分離與培養(yǎng)采集患者和健康體檢者空腹外周血，采用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，再按照試劑盒操作說(shuō)明書操作，提取CD8+T細(xì)胞。將提取的CD8+T細(xì)胞重懸于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，接種于6孔板中，分別加入1 mg/L刺激因子anti-CD3和anti-CD28，于繼續(xù)培養(yǎng)的第4、7天再次加入等量刺激因子，并于10 d收集各組CD8+T細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2外周血和CD8+T細(xì)胞中Mg2+含量檢測(cè)取各組外周靜脈血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中Mg2+濃度；取各組剛分離的CD8+T細(xì)胞，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，取1.5×106/mL的細(xì)胞重懸于HEPES緩沖液（不含Mg2+和 Ca2+），加入 3 μmol/L 熒光探針 Mag-Fura4-AM溶液，37℃避光孵育30 min，加入預(yù)冷的HEPES緩沖液終止探針?lè)跤? 500 r/min離心5 min，棄上清，500 mL HEPES緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)CD8+T細(xì)胞中MagT1 mRNA表達(dá)水平收集培養(yǎng)后的CD8+T細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，利用TaKaRa試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板使用SYBR?Green PCR Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：MagT1 F：5′-ACCTAGCCGGAGCAAAGTTTC-3′，R：5′-CGTCGCAAACGATGAGCAG-3′；β-actin F：5′-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3′，R：5′-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3′。PCR條件：94℃預(yù)變性60 s，94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4Western blot檢測(cè)CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白表達(dá)水平收集培養(yǎng)后的CD8+T細(xì)胞，采用RIPA裂解液抽提細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取15 μg蛋白進(jìn)行上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h，分別加入一抗 MagT1（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，加入ECL超敏發(fā)光液，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀中曝光檢測(cè)，用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件對(duì)各組圖像條帶進(jìn)行分析，結(jié)果用相對(duì)表達(dá)量表示，即以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面分子表達(dá)取各組剛分離的CD8+T細(xì)胞，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，取1.5×105/mL的細(xì)胞重懸于PBS中，分別加入APC標(biāo)記的CD314（NKG2D）抗體、FITC標(biāo)記的CD279（PD-1）抗體、PE/CF594標(biāo)記的Tim-3抗體以及FITC標(biāo)記的CD38抗體，充分混勻后室溫避光孵育30 min，加入預(yù)冷PBS終止反應(yīng)，1 500 r/min離心5 min，棄上清，500 mL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用FlowJo 7.6.1流式軟件分析流式數(shù)據(jù)，結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1慢性HBV感染者外周血和CD8+T細(xì)胞中Mg2+濃度比較慢性HBV感染的兩組感染者外周血Mg2+濃度與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與健康對(duì)照組比較，低病毒載量組和高病毒載量組CD8+T細(xì)胞中Mg2+濃度顯著降低（P＜0.05），并且高病毒載量組CD8+T細(xì)胞中Mg2+濃度顯著低于低病毒載量組（P＜0.05），見表1。

2.2慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA水平的比較與健康對(duì)照組比較，低病毒載量組和高病毒載量組CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA水平均顯著下調(diào)（均P＜0.05）；而高病毒載量組CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA水平又顯著低于低病毒載量組（均P＜0.05），見表2。

表1 各組外周血及CD8+T細(xì)胞中Mg2+濃度比較Tab.1 Comparison of Mg2+concentrations in peripheral blood and CD8+T cells of each group ±s，μmol/L

表1 各組外周血及CD8+T細(xì)胞中Mg2+濃度比較Tab.1 Comparison of Mg2+concentrations in peripheral blood and CD8+T cells of each group ±s，μmol/L

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低病毒載量組比較，bP＜0.05

組別健康對(duì)照組低病毒載量組高病毒載量組F值P值例數(shù)20 41 45外周血946.21±91.75 921.75±84.32 917.96±90.14 0.039 0.997 CD8+T細(xì)胞186.35±24.12 96.77±17.45a 45.36±9.57ab 97.356＜0.001

表2 各組CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA相對(duì)水平的比較Tab.2 Comparison of the relative protein and mRNA levels of MagT1 in CD8+T cells of each group ±s

表2 各組CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA相對(duì)水平的比較Tab.2 Comparison of the relative protein and mRNA levels of MagT1 in CD8+T cells of each group ±s

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低病毒載量組比較，bP＜0.05

組別健康對(duì)照組低病毒載量組高病毒載量組F值P值例數(shù)20 41 45蛋白0.83±0.12 0.43±0.08a 0.15±0.04ab 4.264 0.000 mRNA 1.57±0.17 0.83±0.12a 0.31±0.08ab 6.357 0.000

2.3慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞表面分子PD-1、Tim-3、NKG2D和CD38表達(dá)比較與健康對(duì)照組比較，低病毒載量組和高病毒載量組CD8+T細(xì)胞耗竭表面分子PD-1和Tim-3表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05），CD8+T細(xì)胞功能活化表面分子NKG2D和CD38均顯著降低（均P＜0.05），并且高病毒載量組PD-1和Tim-3表達(dá)又顯著高于低病毒載量組（均P＜0.05），NKG2D和CD38表達(dá)又顯著低于低病毒載量組（均P＜0.05），見表3。

表3 3組CD8+T細(xì)胞表面分子PD-1、Tim-3、NKG2D和CD38表達(dá)比較Tab.3 Comparison of the expression of PD-1，Tim-3，NKG2D and CD38 in CD8+T cells of each group x± s，%

2.4慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞MagT1蛋白表達(dá)與分子PD-1、Tim-3、NKG2D、CD38的相關(guān)性見表4，慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞MagT1蛋白表達(dá)與CD8+T細(xì)胞耗竭分子PD-1、Tim-3均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與CD8+T細(xì)胞功能活化分子NKG2D、CD38均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

3 討論

T細(xì)胞耗竭是慢性感染狀態(tài)下T細(xì)胞發(fā)生的一種功能障礙，主要表現(xiàn)為特異性CD8+T細(xì)胞活性下降所致的對(duì)免疫應(yīng)答反應(yīng)低下，進(jìn)而不能有效控制病毒復(fù)制和清除病毒。有研究［8］顯示，Mg2+可以通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面受體活性參與免疫系統(tǒng)的抗病毒作用。而MagT1是一個(gè)非常重要的鎂離子通道蛋白，有數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)MagT1基因缺失時(shí)，機(jī)體極易發(fā)生感染并具有發(fā)生淋巴瘤的傾向［11］。由此可見，MagT1介導(dǎo)的Mg2+抗病毒作用在病毒性感染疾病中扮演重要作用，可能與其參與調(diào)控T細(xì)胞活性有關(guān)。

Mg2+是細(xì)胞正常代謝所必需的二價(jià)陽(yáng)離子，其在細(xì)胞內(nèi)的含量?jī)H次于K+，具有重要的生理功能。長(zhǎng)期以來(lái)，Mg2+在人類神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管疾病中的作用備受關(guān)注，卻很少有人關(guān)注其在免疫系統(tǒng)中的作用。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV感染者外周血中Mg2+濃度與健康體檢者比較差異無(wú)顯著性，但對(duì)比CD8+T細(xì)胞中Mg2+濃度會(huì)發(fā)現(xiàn)，健康體檢者CD8+T細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度顯著高于HBV感染者，同時(shí)低病毒載量組又高于高病毒載量組。說(shuō)明，Mg2+濃度隨著HBV感染程度的增加而降低，與邵紅玲［12］等研究結(jié)果一致。提示，Mg2+內(nèi)流障礙可能是與CD8+T細(xì)胞免疫功能下降有一定的關(guān)聯(lián)。

Mg2+在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由通道類Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)助完成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與介導(dǎo)Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白主要有 MagT1、TRPM6、TRPM7、Mrs2p、SLC41A1、SLC41A2 和 ACDP2 等［13］。其中，MagT1對(duì)Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)具有高度的選擇性，與免疫缺陷性疾病相關(guān)度較高［14］。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著低于健康體檢者，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高病毒載量組患者CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白和mRNA表達(dá)水平又顯著低于低病毒載量組。說(shuō)明，慢性HBV感染過(guò)程中伴隨著CD8+T細(xì)胞中MagT1表達(dá)逐漸降低，進(jìn)而導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度下降。并且有報(bào)道稱，MagT1基因缺失介導(dǎo)的免疫細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度下降，可促進(jìn)T細(xì)胞耗竭［11］。進(jìn)一步證實(shí)，MagT1介導(dǎo)Mg2+內(nèi)流障礙可能會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞耗竭。

在慢性HBV感染中，已證實(shí)PD-1、Tim-3、CTLA-4等抑制性分子表達(dá)上調(diào)是CD8+T細(xì)胞耗竭的常見指標(biāo)，而NKG2D、CD38、HLA-DR等活性分子表達(dá)上調(diào)則是CD8+T細(xì)胞激活的常見指標(biāo)［2，6］。并且大量研究證實(shí)，在慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞中存在抑制性分子表達(dá)上調(diào)以及活性分子表達(dá)下調(diào)［15-16］。本研究結(jié)果也顯示，與健康體檢者比較，慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞表面抑制性分子PD-1和Tim-3表達(dá)顯著上調(diào)，活性分子NKG2D和CD38表達(dá)顯著下調(diào)。并且相關(guān)性分析顯示，慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞中MagT1蛋白表達(dá)與CD8+T細(xì)胞耗竭分子PD-1、Tim-3均呈負(fù)相關(guān)性，與活化分子NKG2D、CD38均呈正相關(guān)性。該結(jié)果表明，CD8+T細(xì)胞耗竭可能與MagT1表達(dá)異常有關(guān)。

綜上所述，慢性HBV感染過(guò)程中CD8+T細(xì)胞耗竭可能與MagT1表達(dá)異常有關(guān)，其具體機(jī)制可能是MagT1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致Mg2+內(nèi)流障礙，進(jìn)而引起活化分子NKG2D、CD38表達(dá)下調(diào)，抑制分子PD-1、Tim-3表達(dá)上調(diào)，最終造成CD8+T細(xì)胞耗竭。