鄧晶晶 李婷婷 張佳月 張紹蘭

成都醫(yī)學(xué)院（成都 610500）

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1-3］，大多數(shù)的肝癌患者在診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生了肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移而無法進(jìn)行手術(shù)［4-5］，而單純的放療也只能針對(duì)腫瘤局部以及腫瘤周圍組織，對(duì)遠(yuǎn)端的轉(zhuǎn)移無法進(jìn)行控制［6］。此外，肝癌也存在多藥耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了化療藥物的治療效果［3，7］。因此，如果能在分子層面探索和篩選新的藥物靶點(diǎn)，將能夠?yàn)楦伟┲委熖峁┬碌牟呗浴?/p>

MaxiK通道，是細(xì)胞膜上一種鈣離子激活的鉀離子通道，有相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，其高表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用［8］。而細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡方式，其發(fā)生依賴于半胱天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的激活［9-10］。CHU等［11］研究表明，在肝癌細(xì)胞中，其焦亡過程是受到抑制的，由此提示細(xì)胞的焦亡與肝癌的發(fā)病可能存在一定聯(lián)系。

他汀類藥物為臨床上較為廣泛使用的降血脂藥，近年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物的早期應(yīng)用能夠抑制腫瘤的發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移。也有研究報(bào)道稱阿托伐他汀能夠抑制癌細(xì)胞的生長，而其能否對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生積極的作用尚未報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過人肝癌細(xì)胞HepG2的體外培養(yǎng)，檢測(cè)阿托伐他汀對(duì)其增殖的影響，以確定阿托伐他汀是否能抑制其的增殖；以及對(duì)MaxiK通道的表達(dá)是否有影響。探究MaxiK通道在阿托伐他汀對(duì)HepG2細(xì)胞的作用，為肝癌的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞將購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心的HepG2人肝癌細(xì)胞系根據(jù)阿托伐他汀干預(yù)濃度（干預(yù)時(shí)間2 h）分為4組：0 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組。爾后，進(jìn)一步將0 μmol/L組作為對(duì)照組，20 μmol/L組作為實(shí)驗(yàn)組，MaxiK抑制劑paxilline干預(yù)組作為paxilline組。

1.1.2試劑與儀器試劑：PBS、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胰酶、MaxiK抑制劑paxilline、胎牛血清購自Sigma公司；q-PCR引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成；SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡKit、RNase Free dH2O、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR檢測(cè)試劑盒購自TaKaRa公司；MaxiKα抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；Caspase-1和IL-1β抗體購自Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒購自北京索來寶公司；LDH由Sangon生物科技有限公司提供；阿托伐他汀由Nucien制藥有限公司提供；Trizol購自Invitrogen公司；異丙醇溶液由天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供；氯仿溶液由上海生物工程有限公司提供。

儀器：倒置熒光顯微鏡（BH2-RFL-T3型，美國Thermo公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；全自動(dòng)生化分析儀（iMagic-M7型，深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司）；離心機(jī)（JW-1024型，安徽嘉文儀器裝備有限公司）；水平搖床（北京六一儀器廠）電子分析天平（北京Sartorius公司）恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA型，天津市泰斯特儀器有限公司）；96孔板和6孔板（美國Thermo公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；轉(zhuǎn)模架（國產(chǎn)，批號(hào)：180-1903）；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（GR60DA型，致微（廈門）儀器有限公司）；qPCR儀（美國Bio-Rad公司）；電泳儀（DYY-111型，北京六一儀器廠）；全自動(dòng)凝膠成像分析儀（美國UVP公司）；超凈工作臺(tái)（1389型，美國Thermo）。

1.2方法

1.2.1HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃、5%CO2、相對(duì)濕度為95%），待細(xì)胞生長融合至80%～90%時(shí)，用PBS洗2遍后再用0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并按1∶3將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件不變）。選擇生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化離心后重懸并計(jì)數(shù)，按1×105/mL和1×104/mL細(xì)胞數(shù)分別接種于6孔和96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)分組給予不同濃度阿托伐他汀以及paxilline（2 μg/mL）干預(yù)，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞重懸液計(jì)數(shù)，按照1×104/mL細(xì)胞數(shù)接種于96孔板（每孔200 μL），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁（37℃，5%CO2、相對(duì)濕度為95%），更換培養(yǎng)基；分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的阿托伐他汀，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將含有DMSO低于2.5%的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次；培養(yǎng)2 h后，每個(gè)樣品孔加入20 μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，使用移液槍按每孔150 μL加入DMSO后置于孵箱中孵育30 min，在酶標(biāo)儀上振蕩10 min后測(cè)定490 nm處的OD值。

1.2.3乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)HepG2細(xì)胞接種培養(yǎng)及干預(yù)同MTT實(shí)驗(yàn)，在每孔中加入50 μL的乳酸脫氫酶試劑和催化劑（1：45）的混合液，室溫下培養(yǎng)30 min后加入終止試劑結(jié)束反應(yīng)，放入自動(dòng)生化分析儀中進(jìn)行乳酸脫氫酶測(cè)定。

1.2.4q-PCR測(cè)HepG2細(xì)胞MaxiK表達(dá)水平對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞的總RNA的提取采用Trizol法，再利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用q-PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增，用來測(cè)量MaxiK表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GADPH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

1.2.5Western Blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞Caspase1和IL-1β含量取所提蛋白樣品測(cè)濃度，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加樣后用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，爾后再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在室溫條件下封閉1 h（5%脫脂奶粉TTBS溶液）。再用抗Caspase-1和IL-1β抗體（1∶200），抗GAPDH抗體（1∶3 000）孵育，置4℃冰箱過夜。洗膜后再用二抗孵育1 h（37℃），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，然后置于UVP化學(xué)發(fā)光機(jī)中曝光并分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果以（x±s）表示，兩樣本均數(shù)間的兩兩比較采用的是t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1阿托伐他汀能夠劑量依賴性地降低HepG2細(xì)胞的活力通過對(duì)HepG2細(xì)胞采取不同濃度阿托伐他汀干預(yù)2 h后，通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所測(cè)OD值隨著干預(yù)濃度增加而降低（表1，P＜0.05）。結(jié)果表明，在相同的孵育環(huán)境下，阿托伐他汀干預(yù)濃度的增加會(huì)降低HepG2細(xì)胞的活力。

表1 MTT檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of MTT assay ±s

表1 MTT檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of MTT assay ±s

注：與0 μmol/L組比較，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01；與20 μmol/L組比較，cP＞0.05

分組0 μmol/L 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L MTT（OD值）0.619 3±0.006 0.576 5±0.015a 0.318 7±0.037b 0.267 0±0.014c

2.2阿托伐他汀能夠增加HepG2細(xì)胞Caspase-1和IL-1β表達(dá)以及LDH的釋放HepG2細(xì)胞經(jīng)20 μmol/L濃度阿托伐他汀干預(yù)2 h，通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比Caspase-1和IL-1β（圖1A）在干預(yù)組表達(dá)明顯增加。通過LDH釋放試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：阿托伐他汀干預(yù)后的HepG2細(xì)胞LDH流出顯著增加（P＜0.05，圖1B）。上述結(jié)果提示，阿托伐他汀誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞的焦亡。

2.3阿托伐他汀上調(diào)HepG2細(xì)胞MaxiK表達(dá)為了進(jìn)一步探索阿托伐他汀降低對(duì)HepG2細(xì)胞活性影響的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用了qPCR檢測(cè)方法對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞所提取的cDNA進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，阿托伐他汀干預(yù)后HepG2細(xì)胞MaxiK表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05，圖2），提示MaxiK表達(dá)增加是阿托伐他汀降低HepG2細(xì)胞活性增加其焦亡的原因所在。

2.4抑制MaxiK能夠降低HepG2細(xì)胞Caspase-1和IL-1β表達(dá)為了驗(yàn)證MaxiK對(duì)HepG2細(xì)胞焦亡的影響，利用MaxiK特異性抑制劑paxilline（2 μg/mL）對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，爾后通過Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，抑制MaxiK后能夠抑制HepG2細(xì)胞Caspase-1和IL-1β表達(dá)（圖3）。這些結(jié)果提示，MaxiK通道介導(dǎo)了HepG2細(xì)胞的焦亡，并且通過抑制MaxiK通道的表達(dá)能夠減少HepG2細(xì)胞焦亡。

圖1 阿托伐他汀增加HepG2細(xì)胞Caspase-1和IL-1β表達(dá)以及LDH的釋放Fig.1 Expression of Caspase-1 and IL-1β and LDH in HepG2 cell treated by atorvastatin

3 討論

我國每年死于肝癌的患者約有38.3萬例，占世界因肝癌死亡人數(shù)的50%［12］。因此，深入研究和探索藥物對(duì)抑制肝癌細(xì)胞活性的干預(yù)靶點(diǎn)和豐富肝癌的治療措施是很有必要的。

在眾多鉀離子通道中，尤以MaxiK通道最為特殊，它是細(xì)胞膜上一種鈣離子激活的鉀離子通道，也是唯一能將機(jī)體細(xì)胞電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)偶聯(lián)的離子通道，參與了包括動(dòng)作電位形成、激素分泌以及肌肉松弛等體內(nèi)的多種生理過程［13-14］。近年來研究顯示，MaxiK通道具有炎癥反應(yīng)“放大器”的功能特點(diǎn)，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中起著重要的作用［15-16］；作為一類鉀離子通道，它還通過細(xì)胞內(nèi)外鉀離子濃度的調(diào)節(jié)影響了T細(xì)胞的功能，加強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除能力［17-18］。上述研究都提示了MaxiK通道與腫瘤細(xì)胞之間存在著一定關(guān)系，其可能成為一種新的腫瘤治療藥物的作用靶點(diǎn)。

圖2 阿托伐他汀上調(diào)HepG2細(xì)胞MaxiK表達(dá)Fig.2 Changes of MaxiK mRNA levels in HepG2 cells treated with atorvastatin

圖3 抑制MaxiK能夠降低HepG2細(xì)胞Caspase-1和IL-1β表達(dá)Fig.3 Expression of Caspase-1 and IL-1β in HepG2 cell treated by paxilline

有臨床研究表明，他汀類藥物除了能影響血清中的膽固醇水平，也可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移以及血管的生成［19］，還可減少炎癥因子TNF-α的表達(dá)［20］。此外，近年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在慢性丙肝患者中，他汀類藥物能夠劑量依賴性地減緩肝纖維化的進(jìn)程［21］。由于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與微環(huán)境有著密切聯(lián)系，因此認(rèn)為他汀類藥物可能通過其抗炎、抗纖維化的作用發(fā)揮抗肝癌作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。

既往報(bào)道大都集中在藥物干預(yù)后對(duì)各類腫瘤細(xì)胞的凋亡、自噬等細(xì)胞死亡方式的研究上，而對(duì)與焦亡的關(guān)系上研究較少。在對(duì)細(xì)胞焦亡方式的研究中表明，介導(dǎo)caspase-1活化的炎性小體家族成員之一的NLRP3的激活可誘發(fā)肝臟炎癥與纖維化，從而證明NLRP3炎性小體介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡是肝臟損傷的一種新機(jī)制［22］。CHU等［11］的研究也表明，相對(duì)于正常細(xì)胞來說，在肝癌細(xì)胞中，caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平是明顯降低的。上述研究都提示細(xì)胞的焦亡與肝癌的發(fā)病機(jī)制存在一定關(guān)系。

在本研究中，著重探索阿托伐他汀、MaxiK通道和HepG2細(xì)胞焦亡這三者之間的相互關(guān)系。通過在一定時(shí)間內(nèi)觀察阿托伐他汀濃度的變化對(duì)細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可劑量依賴性地降低肝癌細(xì)胞HepG2的活力，可見阿托伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能夠上調(diào)MaxiK的表達(dá)，以及HepG2中細(xì)胞焦亡相關(guān)Caspase-1和IL-1β的水平；而在通過MaxiK特異性抑制劑paxilline對(duì)細(xì)胞的干預(yù)，觀察到Caspase-1和IL-1β的表達(dá)明顯減少，這兩方面數(shù)據(jù)顯示了抑制MaxiK通道會(huì)阻礙HepG2細(xì)胞的焦亡，從而明確了阿托伐他汀通過激活MaxiK通道來介導(dǎo)HepG2細(xì)胞的焦亡。但對(duì)于阿托伐他汀通過MaxiK途徑介導(dǎo)HepG2細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制尚未完全闡明，后續(xù)仍需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了阿托伐他汀通過激活MaxiK通道來介導(dǎo)HepG2細(xì)胞的焦亡，為其成為有效的藥物干預(yù)靶點(diǎn)，也為肝癌的防治提供了新的理論依據(jù)。