孫麗麗

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪 117000)

嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎是以胃腸道嗜酸性粒細(xì)胞異常浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)的胃腸道疾病，多發(fā)于14歲以下兒童，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］.目前關(guān)于嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究［2-3］認(rèn)為與免疫功能異常、變態(tài)反應(yīng)、遺傳因素、藥物等因素有關(guān).血管活性腸肽(Vasoactive Intestinal Peptide，VIP)是一種分布于胃腸黏膜中的非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，具有舒張血管、調(diào)節(jié)免疫、舒張平滑肌等活性，在維持胃腸道正常生理功能方面發(fā)揮重要作用［4］.研究［5］發(fā)現(xiàn):慢性特發(fā)性蕁麻疹發(fā)病過(guò)程中VIP能夠特異性作用于VIP2型受體，調(diào)控肥大細(xì)胞脫顆粒.亦有研究［6］顯示:哮喘患者經(jīng)霧化吸入VIP后可有效減輕臨床癥狀和氣道平滑肌厚度，在抑制氣道重塑方面效果明顯.但VIP及VIP2型受體在嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎中的作用仍鮮有報(bào)道.本研究采用免疫組化法檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒胃竇黏膜組織中VIP，VIP2型受體的表達(dá)情況，分析其與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及IgE水平的關(guān)系，旨在探討VIP，VIP2型受體在兒童嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎發(fā)病中的作用.

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性納入2017年1月—2018年10月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬本溪市中心醫(yī)院收治的嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒40例為觀察組，均符合Talley在美國(guó)明尼蘇達(dá)州的分型標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)具有腹脹、腹瀉、惡心嘔吐等癥狀的患兒行外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IgE水平測(cè)定以及電子胃鏡檢查;其中，男32例，女8例;年齡5個(gè)月～14歲，平均(6.2 7±2.61)歲.收集同期接受胃鏡下病理活檢未見(jiàn)異常的兒童40例為對(duì)照組，外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜10個(gè)/高倍視野，IgE水平正常;其中，男30例，女 10 例;年齡 8 個(gè)月～14 歲，平均(6.04±2.97)歲.兩組受試者性別、年齡之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試兒童及其監(jiān)護(hù)人均自愿參與本研究，且簽署知情同意書(shū).

1.2 方 法

1.2.1 外周血嗜酸性粒細(xì)胞及IgE水平檢測(cè)

收集兩組受試兒童清晨外周靜脈血2 mL分裝至兩個(gè)EP管中，其中一份使用貝克曼LH750型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù);另一份3 000 r/min離心10 min，取上層血清，酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒:江蘇寶萊生物科技有限公司)測(cè)定IgE濃度，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.

1.2.2 標(biāo)本收集與制備

受試兒童接受電子胃鏡(日本奧林巴斯EVIS LUCERA 260型)檢查，留取胃竇黏膜組織標(biāo)本，放入4%的多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，60℃烤片，常溫保存.

1.2.3 嗜酸性粒細(xì)胞HE染色

取標(biāo)本切片脫蠟至水，分別使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟10 min，按順序放入梯度酒精中各5 m in，自來(lái)水沖洗，蘇木精染色5 min，沖洗后5%醋酸分化1 min，沖洗后放入0.6%氨水中返藍(lán)，自來(lái)水沖洗后放入伊紅染液中2 min，依次放入梯度酒精各30 s，二甲苯1 min，中性樹(shù)膠封片.光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察組嗜酸性粒細(xì)胞＞20個(gè)/HPF，對(duì)照組嗜酸性粒細(xì)胞＜10個(gè)/HPF.

1.2.4 免疫組化檢測(cè)VIP及VIP2型受體表達(dá)

取標(biāo)本切片，60℃烤片，20 min后二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水;磷酸緩沖液洗滌后放入枸櫞酸鹽緩沖液中高溫修復(fù)抗原，室溫下冷卻后磷酸緩沖液洗滌;滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶抑制劑，室溫下靜置10 min;洗滌后滴加山羊非免疫血清封閉30 min，棄去封閉液;滴加鼠抗人VIP多克隆抗體、鼠抗人VIP2型受體多克隆抗體，均為1∶500倍稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜;磷酸緩沖液洗滌后滴加山羊抗兔IgG，1∶2 000倍稀釋?zhuān)覝叵路磻?yīng)1 h，滴加DAB顯色液，流水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染4 min，流水沖洗返藍(lán);脫水、透明后中性樹(shù)膠封片.光學(xué)顯微鏡下每張切任意選取3個(gè)視野，通過(guò)圖像分析軟件Image-Pro Plus7.0得到吸光度值.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，研究數(shù)據(jù)分別以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)、百分率表示，行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性進(jìn)行Spearman分析，以 P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試兒童外周血嗜酸性粒細(xì)胞及IgE水平

觀察組患兒外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IgE水平均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).見(jiàn)表 1.

2.2 兩組受試兒童胃鏡下組織變化情況

胃鏡下觀察，觀察組患兒黏膜充血水腫、潰瘍、糜爛、結(jié)節(jié)樣增粗的比例明顯高于對(duì)照組，差異具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).見(jiàn)表2.

表1 兩組受試兒童外周血嗜酸性粒細(xì)胞及IgE水平Tab.1Eosinophils and IgE levels in peripheral blood of children in two groups(珋x±s)

表2 兩組受試兒童胃鏡下組織變化情況Tab.2 Analysis of tissue changes under gastroscopyof children in two groups n(η/%)

2.3 兩組受試兒童胃竇黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量

HE染色顯示:觀察組患兒胃竇黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增加.見(jiàn)圖1.觀察組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量平均(43.05±20.71)個(gè)/HPF，其中 20～40個(gè)/HPF的患兒22例，41～60個(gè)/HPF的患兒14例，＞60個(gè)/HPF的患兒4例.對(duì)照組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量平均(8.94±1.80)個(gè)/HPF;觀察組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.381，P=0.000).

圖1 兩組受試兒童胃竇黏膜組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of gastric antrum mucosa of children in two groups(×200)

2.4 兩組受試兒童胃竇黏膜組織中VIP及VIP2型受體表達(dá)情況

胃竇黏膜組織中VIP及VIP2型受體陽(yáng)性表達(dá)為黃色或棕黃色.觀察組VIP陽(yáng)性表達(dá)的吸光度值明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0 5);觀察組VIP2型受體陽(yáng)性表達(dá)的吸光度值明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).見(jiàn)圖2，表 3.

圖2 兩組胃竇黏膜組織中VIP及VIP2型受體陽(yáng)性表達(dá)Fig.2 Positive expression of VIP and VIP2 receptors in antral mucosa of two groups(DAB，×200)

表3 兩組胃竇黏膜組織中VIP及VIP2型受體陽(yáng)性表達(dá)的吸光度值Tab.3 Absorbance values of positive expression of VIP and VIP2 receptors in antral mucosa between two groups(珋x±s)

2.5 VIP及VIP2型受體表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量、IgE水平相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示:觀察組患兒胃竇黏膜組織中VIP陽(yáng)性表達(dá)量與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=－0.647，P＜0.01)，與 IgE 水平呈負(fù)相關(guān)(r=－0.759，P＜0.01);觀察組患兒胃竇黏膜組織中VIP2型受體陽(yáng)性表達(dá)量與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=－0.817，P＜0.01)，與 IgE 水平呈負(fù)相關(guān)(r=－0.850，P＜0.01).

3 討 論

兒童嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎臨床癥狀主要包括腹部脹痛、嘔吐、便血等［7］.研究者根據(jù)嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎浸潤(rùn)深度、累及部位分為3種亞型，分別為黏膜型、肌層型、漿膜型，可共存或單獨(dú)存在［8］.本研究收集的40例嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒均存明顯的消化道癥狀，以腹痛最為明顯;以黏膜型為主，另有8例漿膜型，未發(fā)現(xiàn)肌層型，可能與胃鏡下病理活檢夾取的深度不夠有關(guān).相關(guān)研究［9］顯示:急性胃腸炎患兒外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IgE水平明顯升高，且能夠反映出病情的嚴(yán)重程度.本研究中觀察組患兒外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IgE水平均明顯高于對(duì)照組，與上述研究報(bào)道一致，提示嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒亦存在嗜酸性粒細(xì)胞、IgE水平升高.目前嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎診斷主要通胃鏡下多點(diǎn)活檢，且組織病理學(xué)檢查1處及以上的嗜酸性粒細(xì)胞＞20 個(gè)/HPF［10］.本研究中酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒胃鏡下以黏膜充血水腫為主要表現(xiàn)，其次為潰瘍、糜爛、結(jié)節(jié)樣增粗.

VIP是廣泛存在于中樞神經(jīng)及胃腸壁內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，由28個(gè)氨基酸構(gòu)成［11］.有研究［12］顯示:VIP在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮胃腸道激素和神經(jīng)肽的雙重作用，能夠擴(kuò)張心腦血管、降低血壓、舒張支氣管平滑肌等.在消化系統(tǒng)中以舒張腸道平滑肌為主，并松弛食管下括約肌、肛門(mén)內(nèi)括約肌、Oddi括約肌［13］.VIP 通過(guò)特異性受體發(fā)揮生物學(xué)活性，包括 VIP1型受體、VIP2型受體［14］.VIP1型受體分布于肝、肺、主動(dòng)脈等外周組織中，VIP2型受體分布更廣泛，在除肝臟、主動(dòng)脈之外的所有組織中均有分布，為神經(jīng)內(nèi)分泌VIP受體.本研究顯示:嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒的胃竇黏膜組織中VIP和VIP2型受體含量明顯高于對(duì)照組.人胃腸道黏膜組織中分布有大量的VIP神經(jīng)纖維，與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞相互作用，形成神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò).本研究中嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎患兒胃竇黏膜組織中VIP和VIP2型受體含量均與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量、IgE水平呈負(fù)相關(guān).

綜上所述，兒童嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎的發(fā)生可能與胃竇黏膜VIP含量減少有關(guān).結(jié)合相關(guān)研究報(bào)道，VIP可通過(guò)抑制血小板活化因子介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶活性增加，下調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，降低嗜酸性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附;推測(cè)其機(jī)制:胃黏膜VIP含量下降導(dǎo)致與嗜酸性粒細(xì)胞表面VIP2型受體結(jié)合減少，對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞與胃竇黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用下降，導(dǎo)致胃竇嗜酸性粒細(xì)胞聚集并發(fā)生脫顆粒，分泌損傷性因子，從而誘發(fā)了嗜酸性粒細(xì)胞增多性胃腸炎.