楊安卿，夏 宇

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院，上海 200025;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025)

間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征是一種病因尚未明確、以膀胱慢性疼痛為主要癥狀的嚴重膀胱炎癥綜合征［1］，對患者身心健康及生存質(zhì)量的不良影響不亞于慢性癌癥疼痛、腎臟透析［2］.目前，包括膀胱切除在內(nèi)的間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征臨床治療方案均難以獲得滿意的效果［3］.相關(guān)研究［4］顯示:自身免疫、膀胱黏膜屏障受損、炎癥反應、神經(jīng)異常興奮等均與間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征發(fā)病有關(guān)，其中肥大細胞活化引發(fā)的膀胱免疫反應是研究熱點之一.本研究收集了42例間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者的膀胱黏膜組織，透射電子顯微鏡觀察肥大細胞脫顆粒情況，免疫組化法檢測白細胞介素IL-2，IL-10，Siglec-15的表達水平，探討免疫因子在間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征發(fā)生、發(fā)展中的作用.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2018年10月上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院收治的間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者42例為觀察組，均符合加拿大泌尿外科協(xié)會(CUA)頒布的間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征診治指南中的標準.其中，男6例，女36例;年齡 49～75 歲，平均(55.38±2.52)歲;病程 10～25 個月，平均(15.95±3.63)個月.收集同期行輸尿管鏡檢查的18例患者正常膀胱組織為對照組，其中，男3 例，女15 例;年齡51～73 歲，平均(54.95±2.17)歲.兩組受試者性別、年齡之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，所有觀察組患者盆腔疼痛和尿頻、尿急癥狀(PUF)評分在18～30分，平均(25.10±2.85)分.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者均簽署知情同意書.

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集與制備

間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者行膀胱鏡隨機活檢及硬膜外麻醉下水擴張，觀察擴張前后膀胱黏膜情況并取活檢組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片.對照組在行輸尿管鏡檢查時隨機取膀胱黏膜組織，制備方法同觀察組.

1.2.2 透射電子顯微鏡觀察

預冷的生理鹽水洗滌標本后，用手術(shù)刀分割為邊長為1 mm的組織塊，放入2.5%的戊二醛溶液，4℃下固定過夜;次日用磷酸緩沖液洗滌3次，1%鋨酸固定，丙酮梯度脫水，包埋后光鏡切片，檸檬酸鉛與醋酸雙氧鈾雙染色，透射電子顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.3 免疫組化染色

取膀胱黏膜組織切片，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，熱抗原修復.3%正常山羊血清封閉，滴加鼠抗人IL-2單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人IL-10單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人Siglec-15單克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜;次日滴加HRP標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG，均為1∶1 000稀釋，室溫下反應2 h，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明后封片.磷酸緩沖液代替一抗為空白對照.結(jié)果判定:光學顯微鏡下每張切片隨機取5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞.細胞中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)染色強度分為無染色(陰性)、黃色(弱陽性)、棕黃色(強陽性).

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，計數(shù)用百分率表示，行方差分析、t檢驗、χ2檢驗，以 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié) 果

2.1 透射電子顯微鏡下漿細胞和肥大細胞的表達

觀察組42例間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者中36例(85.71%)在透射電子顯微鏡下觀察可見漿細胞和肥大細胞，其中肥大細胞出現(xiàn)脫顆粒狀態(tài)26例(72.22%).見圖1.對照組膀胱黏膜組織中透射電子顯微鏡下未見漿細胞和肥大細胞.

圖1 透射電子顯微鏡下觀察組患者膀胱黏膜組織中漿細胞和肥大細胞Fig.1 Plasma cells and mast cells in bladder mucosa of patients in observation group by transmission electron microscopy

2.2 兩組膀胱黏膜組織中 IL-2，IL-10，Siglec-15的表達情況

觀察組患者膀胱黏膜組織中IL-2，IL-10呈弱陽性、強陽性表達的比例明顯高于對照組，IL-2，IL-10呈陰性表達的比例明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);膀胱黏膜組織中Siglec-15表達情況在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05).見表1.觀察組患者膀胱黏膜組織中 IL-2，IL-10，Siglec-15陽性表達情況見圖2.

表1 兩組膀胱黏膜組織中IL-2，IL-10，Siglec-15的表達情況Tab.1 Expression of IL-2，IL-10 and Siglec-15 in bladder mucosa between two groups n(η/%)

圖2 IL-2，IL-10，Siglec-15在觀察組患者膀胱黏膜組織中陽性表達Fig.2 Positive expression of IL-2，IL-10 and Siglec-15 in bladder mucosa of patients in observation group(SP×400)

2.3 觀察組膀胱黏膜組織中IL-2，IL-10，Siglec-15表達與PUF評分的關(guān)系

觀察組IL-2強陽性患者的PUF評分明顯高于弱陽性和陰性患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);IL-10強陽性患者的PUF評分明顯高于弱陽性和陰性患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Siglec-15陰性患者的PUF評分明顯低于陽性和強陽性患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01).見表 2.

表2 觀察組膀胱黏膜組織中IL-2，IL-10，Siglec-15表達與PUF評分的關(guān)系Tab.2 Relationship among the expression of IL-2，IL-10，Siglec-15 and PUF score in bladder mucosa of observation group

表2 觀察組膀胱黏膜組織中IL-2，IL-10，Siglec-15表達與PUF評分的關(guān)系Tab.2 Relationship among the expression of IL-2，IL-10，Siglec-15 and PUF score in bladder mucosa of observation group

注:與陰性表達比較，a:P＜0.05

?

3 討 論

間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征的發(fā)病機制目前仍未明確，相關(guān)研究［5］顯示:間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征與其他自身免疫性疾病具有部分相同的特點，并以膀胱黏膜組織中肥大細胞增殖活性為突破口進行探究.本研究在透射電子顯微鏡下可觀察到間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者膀胱黏膜組織中存在漿細胞和肥大細胞，且其中72.22%的患者出現(xiàn)肥大細胞脫顆粒現(xiàn)象.漿細胞主要通過分泌IgE抗體激活肥大細胞發(fā)揮生物學活性.有研究［6］發(fā)現(xiàn):間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者膀胱層均被漿細胞浸潤，抑制膀胱黏膜組織中肥大細胞脫顆粒是目前間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征治療的熱點之一［7］.

研究［8］發(fā)現(xiàn):T細胞分泌的IL-2，IL-10等細胞因子可誘發(fā)B細胞增殖并產(chǎn)生IgG，IgE等抗體，與肥大細胞受體特異性結(jié)合后活化肥大細胞，分泌并釋放組胺、前列腺素、白三烯、趨化因子、一氧化氮等炎癥因子，導致炎癥反復發(fā)作.組織學研究［9］顯示:間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者膀胱壁組織中存在嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞浸潤，IL-10等介導免疫反應的Th2類細胞可活化嗜酸性粒細胞、巨噬細胞，分泌并釋放白三烯、組胺等炎癥因子，增加毛細血管通透性和平滑肌收縮性，IL-10表達水平與間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者臨床癥狀明顯相關(guān).IL-2在人體多種正常上皮組織中均存在表達，參與體內(nèi)免疫應答過程［10］.IL-2在淋巴細胞、肥大細胞、血管內(nèi)皮細胞中表達上調(diào)，在間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征中與干細胞因子具有協(xié)同作用，可促進肥大細胞增［11］.本研究顯示:觀察組膀胱黏膜組織中IL-2，IL-10陽性表達率明顯高于對照組，且觀察組IL-2，IL-10強陽性患者的PUF評分明顯高于弱陽性和陰性患者，提示肥大細胞相關(guān)炎癥因子在間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且與病情嚴重程度具有一致性.

活化和抑制作用平衡在維持人體免疫系統(tǒng)正常生理功能方面具有重要作用，免疫細胞中抑制因子表達下調(diào)會引發(fā)自身免疫性疾病，磷酸化信號通路介導肥大細胞活化，抑制該通路相關(guān)受體可下調(diào)肥大細胞活性［12］.Siglec家族是肥大細胞表達的抑制性受體，多表達于免疫細胞上的跨膜黏附蛋白，具有抑制免疫細胞信號調(diào)節(jié)的作用［13］.肥大細胞可選擇性表達Siglec-15，并與唾液酸配體結(jié)合后發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，抑制肥大細胞脫顆粒.本研究顯示:間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者中Siglec-15陽性表達者的PUF評分明顯低于陰性者，提示Siglec-15陽性表達可緩解間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征患者的臨床癥狀;但Siglec-15表達在觀察組與對照組之間無明顯差異，可能與間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征屬于免疫性疾病有關(guān).相關(guān)研究［14］顯示:使用單克隆抗體激活Siglec-15后可抑制IgE受體活化，進而抑制肥大細胞脫顆粒.因此，Siglec-15作為肥大細胞表面的選擇性靶點有望成為間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征治療的新途徑.