王佳燁，王曉麗，王新婷，單瑩瑩，李 賀，王春梅，孫紅霞，張成義，陳建光，孫靖輝

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

五味子是木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的成熟干燥果實(shí)，具有極高的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，是一種新型的既可藥用也可食用的功能性保健食品［1］.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:中藥五味子中的化學(xué)成分有木脂素、揮發(fā)油、多糖等，其中木脂素類成分是其主要化學(xué)成分，具有肝保護(hù)、抗病毒、抗糖尿病、抗炎等功能［2-3］.有關(guān)五味子木脂素的提取方法有很多，包括超聲提取法、超臨界CO2流體萃取法、大孔吸附樹脂法、滲漉法、回流法、索氏提取法等，但不同提取方法之間所得到的五味子木脂素提取率略有差異［4-7］.現(xiàn)通過對(duì)超聲提取法、超臨界CO2流體萃取法和大孔吸附樹脂法進(jìn)行比較，探討3種提取方法對(duì)五味子木脂素提取率的影響.

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(Waters，USA，型號(hào)e2695)配有UV檢測器(型號(hào)2998PDA)和色譜管理系統(tǒng)(版本號(hào)Millennium32);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司，型號(hào)R206B);超臨界CO2流體萃取儀(沈陽索福爾超臨界萃取設(shè)備有限公司，型號(hào)TC-SFE-36-10-320S);AS系列超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司，型號(hào)AS5150A).

1.2 材料和試劑

五味子(吉林省集安五味子種植基地，由北華大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室李鳳麗教授鑒定為木蘭科植物五味子的成熟干燥果實(shí));分析級(jí)甲醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司);95%的乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);大孔吸附樹脂(HPD100，上海紫一試劑廠);五味子木脂素類成分標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，五味子醇甲(批號(hào):wkq182022702)、五味子酯甲(批號(hào):wkq18052805)、五味子醇乙(批號(hào):wkq18020804)、五味子乙素(批號(hào):wkq18030811)、五味子丙素(批號(hào):wkq18020607)、五味子甲素(批號(hào):wkq18032609)、五味子酚(批號(hào):151116))，以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均超過98%;HPLC級(jí)甲醇、乙腈和乙酸乙酯(TEDIA，USA);實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水.

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子木脂素提取工藝

2.1.1 大孔吸附樹脂法

將五味子粉碎，過40目篩，然后稱取150 g五味子粉末，加入1 200 mL的95%乙醇回流1 h，連續(xù)提取兩次，合并兩次的濾液，進(jìn)行抽濾旋蒸.加入蒸餾水使乙醇濃度達(dá)到70%，放置24 h后進(jìn)行抽濾旋蒸，加蒸餾水將提取液定容至濃度為0.1 g/mL.用大孔吸附樹脂灌柱，柱高與直徑比為1∶6，加入提取液(若V柱=25 c m3，則V樣=70 mL).當(dāng)提取液快達(dá)到大孔樹脂以下時(shí)加入蒸餾水除去雜質(zhì)(若V柱=25 cm3，則V樣=50 m L)，之后用95%的乙醇洗脫(若V柱=25 cm3，則V樣=100 mL)，收集乙醇洗脫液進(jìn)行旋蒸.最后將旋蒸液在水浴鍋上加熱至完全無醇味，冷凍干燥，最終得到五味子木脂素粉末5 g，提取率為3.33%.

2.1.2 超臨界 CO2流體萃取法

參考文獻(xiàn)［8-9］方法，將五味子粉碎，過40目篩，稱取150 g五味子粉末，加入萃取釜中，打開水浴，通入CO2，設(shè)定溫度為45℃，當(dāng)萃取裝置達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，打開壓縮泵調(diào)節(jié)壓力為30 MPa，將CO2流量調(diào)整為15 L/h，進(jìn)行循環(huán)萃取120 min，待萃取完畢，關(guān)閉壓縮機(jī)、鋼瓶，放空CO2，將收集的液體進(jìn)行冷凍干燥，得到五味子木脂素粉末 44.7 g，提取率為 29.8%.

2.1.3 超聲提取法

參考文獻(xiàn)［10-11］方法，將五味子粉碎，過40目篩，精密稱取150 g五味子粉末，置于具塞三角瓶中，加入90%乙醇3 000 mL，超聲提取30 min，將所得液體進(jìn)行抽濾旋蒸，將旋蒸液在水浴鍋上加熱直至完全無醇味，冷凍干燥，最終得到五味子木脂素粉末21.42 g，提取率為14.28%.

2.2 色譜條件

五味子木脂素的測定參考苑廣信等［12］的HPLC方法，色譜柱:Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);島津 GVP 保護(hù)柱(4.6 mm);流動(dòng)相:甲醇(A)，水(B)，梯度條件見表 1;柱溫:27 ℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:230 nm;進(jìn)樣量:10 μL.

表1HPLC梯度條件Tab.1 HPLC gradient conditions

2.3 溶液的制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素和乙素各3 mg，五味子丙素和五味子酚各2 mg，用適量甲醇超聲溶解后定容于10 mL容量瓶中，得對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，并作為混合?biāo)準(zhǔn)品.

2.3.2 五味子木脂素樣品溶液的制備

取3種提取方法所得到的提取物各50 mg，用適量甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL的樣品儲(chǔ)備液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫⒆鳛榇郎y樣品.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

將混合標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至不同倍數(shù)，得到8個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，濃度0.006～0.300mg/mL.分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各1.0 mL，注入進(jìn)樣品中，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積.以峰面積y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得各組分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見圖1和表2.結(jié)果顯示:各組分在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［13-14］.

2.4.2 定量限(LOQ)和檢出限(LOD)

精密量取混合對(duì)照品溶液1 mL，采用倍比稀釋法制成系列質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)行色譜分析，記錄色譜峰面積，以信噪比10∶1作為定量限，信噪比3∶1作為檢出限.測得五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的定量限分別為 20，18，14，18.5，18，19.5，17 μg/mL;檢出限分別為 7，4，3.5，4.5，5，6.5，5.5 μg/mL.

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行色譜分析，連續(xù)測定6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄各色譜峰的相對(duì)峰面積，以峰面積計(jì)算RSD，RSD值為0.76%～1.89%，結(jié)果顯示:本方法測定的7種木脂素含量的精密度良好.

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取 0.1 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，按 2.2 色譜條件，分別于 1，2，4，8，16，24 h 進(jìn)樣測定，記錄各色譜峰的相對(duì)峰面積，以峰面積計(jì)算RSD，RSD值為0.84%～1.77%，結(jié)果顯示:本方法在24 h內(nèi)測定的7種木脂素含量的穩(wěn)定性良好.

2.4.5 重復(fù)性考察

取五味子原藥材，按2.1中的3種方法提取五味子木脂素，每種方法提取的五味子木脂素均平行制備5份濃度為5 mg/mL的供試品溶液，進(jìn)行色譜分析，記錄各色譜峰的相對(duì)峰面積，以峰面積計(jì)算RSD，大孔吸附樹脂法提取得到的7種木脂素RSD值為0.79%～1.88%，超臨界CO2流體萃取法提取得到的7種木脂素的RSD值為0.66%～1.72%，超聲法提取得到的7種木脂素的RSD值為0.93%～1.91%，結(jié)果顯示:本方法測定樣品中7種木脂素含量的重復(fù)性良好.

2.4.6 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已知7種木脂素含量的藥材粉末9份，每份0.1 g，分別按高中低3個(gè)濃度精密加入7種木脂素對(duì)照品溶液，每一濃度平行加入3份，制備得樣品溶液，進(jìn)行色譜分析，計(jì)算回收率.計(jì)算可知，在高中低3個(gè)加標(biāo)濃度下，7種木脂素的平均回收率為94.3%～103.7%，回收率RSD值為 0.8 6%～1.75%，結(jié)果顯示:本方法測定的7種木脂素含量的回收率良好.

2.5 樣品測定

分別取3種提取方法得到的木脂素待測樣品溶液各1 mL，通過0.45 μm的有機(jī)膜注入進(jìn)樣瓶中，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，求得樣品中7種木脂素的含量，每種提取方法均平行實(shí)驗(yàn)3次.結(jié)果見圖2和表3.

3 討 論

就五味子木脂素的提取方法而言，傳統(tǒng)溶劑提取耗時(shí)，溶劑需求量大，工藝復(fù)雜，流程長，重現(xiàn)性差，提取效率低，存在許多固有的缺陷，且常用的有機(jī)溶劑大多有毒，易造成環(huán)境污染，危害實(shí)驗(yàn)操作人員的健康［15］.現(xiàn)代科技的發(fā)展優(yōu)化了傳統(tǒng)的提取方法，使五味子木脂素的提取無論在實(shí)驗(yàn)操作安全還是提取率上都大大增強(qiáng).超臨界CO2萃取法臨界溫度低，提取原料中的有效成分能被很好保存，特別適合提取對(duì)熱敏感、易氧化分解的成分.另外，超臨界CO2萃取法提取能力強(qiáng)，產(chǎn)率高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和生物工程等領(lǐng)域［15］，但相對(duì)其他兩種提取方法而言，此方法所采用的機(jī)器成本較高.超聲提取法具有提取時(shí)間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、操作簡單易行的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥的提取分離中［16］.大孔吸附樹脂法具有吸附性能好、價(jià)格低廉、可再生利用、洗脫劑安全、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)［17］.從提取率上看，用超臨界CO2流體萃取法提取的五味子木脂素提取率最高，總量可達(dá) 18.94 mg/g，提取物的提取率為 29.8%，遠(yuǎn)高于另外兩種方法得到的提取物含量.超聲提取法所提取的五味子木脂素含量為17.96 mg/g，得到提取物的提取率為14.28%.大孔吸附樹脂提取五味子木脂素含量較少，為10.90 mg/g，得到提取物的提取率為3.33%，分析原因可能由于大孔吸附樹脂雖然能除去雜質(zhì)，但是也損耗了相當(dāng)一部分木脂素.通過對(duì)五味子木脂素提取方法的不斷探索和優(yōu)化，期望得到更高純度的五味子木脂素.本研究比較了3種方法提取五味子木脂素的優(yōu)缺點(diǎn)，為五味子木脂素提取方法的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).