喬慶龍,周 偉,陳 婕,劉文娟,苗 露,尹文婷,徐兆超

(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧 大連 116023)

蛋白是生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的研究對(duì)象,參與多種生命過(guò)程中所必需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其功能通過(guò)與小分子、DNA、其他蛋白底物之間相互作用實(shí)現(xiàn)[1,2]。因此,對(duì)蛋白的原位分析,包括蛋白識(shí)別、蛋白分布及實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤等,能夠更真實(shí)地揭示蛋白在生理過(guò)程中發(fā)揮的作用。然而,紫外吸收法、圓二色光譜法、電化學(xué)法、紅外光譜法、核磁共振法等均很難實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞及活體內(nèi)蛋白的原位分析[3]。

基于有機(jī)小分子的熒光分析法能夠在不破壞原生環(huán)境下對(duì)蛋白進(jìn)行監(jiān)測(cè)。相比于傳統(tǒng)基于熒光蛋白的分析法[4-6],有機(jī)小分子具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、顏色可選擇多、易改造等優(yōu)點(diǎn),因此其在蛋白識(shí)別、標(biāo)記領(lǐng)域逐漸成為熒光蛋白的替代者[7-10]。然而,有機(jī)小分子染料通常源于人工合成,無(wú)法像熒光蛋白一樣由細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生。這就為小分子應(yīng)用于蛋白原位分析中帶來(lái)了諸多問(wèn)題:如有機(jī)小分子熒光染料在細(xì)胞中分布不均勻,易產(chǎn)生非特異性標(biāo)記,細(xì)胞毒性大等。其中,有機(jī)小分子的非特異性標(biāo)記問(wèn)題尤為突出,科研工作者無(wú)法像熒光蛋白分析法一樣控制目標(biāo)蛋白上連接有機(jī)小分子的數(shù)量及位置。因此,這引發(fā)化學(xué)家去開(kāi)發(fā)新的生物正交方法,并基于生物正交的方式將小分子染料定點(diǎn)、共價(jià)連接到目標(biāo)蛋白上,進(jìn)一步通過(guò)熒光信息跟蹤、研究目標(biāo)蛋白的位置和功能。目前應(yīng)用最廣泛的生物正交方式是基于酶促反應(yīng)的蛋白標(biāo)簽技術(shù),如SNAP-tag、Halo-tag、PYP(Photoactive yellow protein)-tag等。SNAP-tag標(biāo)簽蛋白是人源DNA修復(fù)蛋白的O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶(hAGT)的突變體[11,12],能夠快速、特異性地與芐基鳥(niǎo)嘌呤(BG)或芐基氯嘧啶(CP)的衍生物反應(yīng),進(jìn)而使SNAP-tag蛋白與有機(jī)小分子之間形成穩(wěn)定的硫醚鍵,融合有SNAP-tag的目標(biāo)蛋白能夠特異性地連接一個(gè)探針?lè)肿印?/p>

目前,基于SNAP-tag技術(shù)與小分子熒光染料已開(kāi)發(fā)出多種商業(yè)的SNAP-tag熒光探針,該類熒光探針通常由環(huán)境不敏感的熒光團(tuán)(如:羅丹明、花菁染料、熒光素等)與芐基鳥(niǎo)嘌呤兩部分構(gòu)成。雖然,這類探針與SNAP-tag標(biāo)簽蛋白能夠達(dá)到很高的反應(yīng)速率,但是反應(yīng)前后熒光信號(hào)變化通常較小(增強(qiáng)1～2倍)。因此,這類探針在對(duì)細(xì)胞著色后存在較高的熒光背景,需要多次洗滌以除去未反應(yīng)或非特異性標(biāo)記的分子,才能達(dá)到高的信噪比。細(xì)胞的洗滌往往會(huì)造成時(shí)間分辨率的降低,對(duì)于蛋白動(dòng)力學(xué)分析帶來(lái)不利。因此,開(kāi)發(fā)增強(qiáng)型的SNAP-tag熒光探針(即與SNAP-tag標(biāo)簽蛋白結(jié)合后熒光信號(hào)明顯增強(qiáng))顯得尤為迫切。環(huán)境敏感型染料能夠通過(guò)熒光信號(hào)的變化對(duì)分子周圍環(huán)境微小改變進(jìn)行快速、靈敏的響應(yīng)(通常水中熒光量子產(chǎn)率很低),因此這類染料逐漸被應(yīng)用于SNAP-tag探針的設(shè)計(jì)中。通常這類探針由水環(huán)境中到SNAP-tag較為疏水的蛋白表面或空腔后,熒光信號(hào)會(huì)明顯增強(qiáng),從而達(dá)到免洗的效果[13-15]。Tan課題組[16-18]以環(huán)境敏感型染料(4-磺酰胺基-7-氨基苯并惡二唑,SBD)為發(fā)光基團(tuán),設(shè)計(jì)合成了用于活細(xì)胞內(nèi)免洗熒光成像的SNAP-tag探針BGSBD。與SNAP-tag結(jié)合后其熒光增強(qiáng)約280倍,實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)原位蛋白的熒光成像,但是該探針的絕對(duì)亮度較低,不能滿足超分辨熒光成像需求。針對(duì)以上問(wèn)題,本研究基于傳統(tǒng)的環(huán)境敏感型熒光染料萘酰亞胺,結(jié)合SNAP-tag蛋白標(biāo)記技術(shù)設(shè)計(jì)合成免洗的用于蛋白原位分析的熒光探針[19-21];同時(shí),通過(guò)芐基鳥(niǎo)嘌呤的位置選擇提高探針信噪比、選擇性及反應(yīng)速率,以滿足不同實(shí)驗(yàn)方案及領(lǐng)域?qū)ψR(shí)別與標(biāo)記效果的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

核磁共振氫譜(1H NMR)在Bruker (AVANCE III 400/101MHz)波譜儀上測(cè)試得到,其中以0.03%(v/v)的四甲基硅烷作為基準(zhǔn)物質(zhì)。紫外/可見(jiàn)吸收光譜與熒光發(fā)射光譜分別在Agilent Cary 60 UV-Vis分光光度計(jì)及Agilent CARY Eclipse熒光光譜儀上測(cè)得。溶劑pH在Sartorius PB-10的pH計(jì)上測(cè)得。生物細(xì)胞成像則在Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡上測(cè)得,其中鏡頭選取100倍油鏡(NA=1.40)。

分子合成所使用試劑為國(guó)產(chǎn)(伊諾凱公司和百靈威公司)或進(jìn)口(Sigma-Aldrich公司)試劑,未經(jīng)特殊說(shuō)明外,均為分析純,直接使用。商業(yè)化染料細(xì)胞核染料Hoechst 33342與線粒體商業(yè)染料MitoTracker Red均購(gòu)自凱基生物公司。柱色譜分離純化用硅膠粉型號(hào)為200～300目(伊諾凱公司)。生物測(cè)試用商業(yè)化亞細(xì)胞器標(biāo)記染料(美國(guó)Life Technologies公司)。生物細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM及1640培養(yǎng)基、青鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司);優(yōu)質(zhì)胎牛血清(以色列Biological Industries)。

1.2 探針合成

1.2.1探針BGAN-Amino的合成

依次稱取4-氨基-N-(4-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)芐基-1,8-萘酰亞胺(AN-Amino)(30 mg,0.09 mmol)、2-氨基-6-(N-甲基)四氫吡咯氨基嘌呤氯鹽(BG+)(81 mg,0.27 mmol)和叔丁醇鉀(70 mg,0.54 mmol)溶于5 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?0 h后停止反應(yīng)(見(jiàn)圖1)。減壓除去DMF,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離純化(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇,15∶1,v/v),通過(guò)薄層色譜板監(jiān)測(cè)產(chǎn)物流出,所得產(chǎn)物減壓除去溶劑得黃色粉末26 mg,產(chǎn)率62%。

1.2.2探針mBGAN-2C的合成

依次稱取4-乙氨基-N-(3-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)芐基-1,8-萘酰亞胺(mAN-2C)(50 mg,0.14 mmol)、BG+(105 mg,0.41 mmol)和叔丁醇鉀(90 mg,0.80 mmol)溶于5 mL干燥的DMF中,在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢? h后停止反應(yīng)(見(jiàn)圖2)。減壓除去DMF,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱(200～300目)分離純化(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇,20∶1,v/v),通過(guò)薄層色譜板監(jiān)測(cè)產(chǎn)物流出,所得產(chǎn)物減壓除去溶劑得黃色粉末33 mg,產(chǎn)率48%。

1.2.3探針4BGAN-Bu的合成

依次稱取4-(4-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)芐基-N-丁基-1,8-萘酰亞胺(4AN-Bu)(100 mg,0.26 mmol)、BG+(197 mg,0.77 mmol)和叔丁醇鉀(175 mg,1.56 mmol)溶于5 mL干燥的DMF中,在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?0 h后停止反應(yīng)(見(jiàn)圖3)。減壓除去DMF,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離純化(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇,15∶1,v/v),通過(guò)薄層色譜板監(jiān)測(cè)產(chǎn)物流出,所得產(chǎn)物減壓除去溶劑得到黃色粉末26 mg,產(chǎn)率19%。

圖1 探針BGAN-Amino的合成Fig.1 Synthesis of BGAN-Amino t-BuOK:potassium tert-butoxide;DMF:N,N-dimethylformamide.

圖2 探針mBGAN-2C的合成Fig.2 Synthesis of mBGAN-2C

圖3 探針4BGAN-Bu的合成Fig.3 Synthesis of4BGAN-Bu

1.3 探針的紫外吸收與熒光發(fā)射光譜測(cè)試

準(zhǔn)確稱取待測(cè)探針化合物溶于色譜純二甲基亞砜(DMSO)溶液中配制成2 mmol/L測(cè)試母液。準(zhǔn)確量取一定體積的母液加入到測(cè)試體系中以配制成所需測(cè)試濃度(1～10 μmol/L)(其中DMSO所占體積分?jǐn)?shù)小于0.5%)進(jìn)行吸收與熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。

分別取2.5 μL探針母液加入1 mL磷酸緩沖液中(PBS,20 mmol/L,pH 7.4)配制為5 μmol/L的測(cè)試液進(jìn)行吸收及熒光發(fā)射光譜測(cè)試,DMSO含量為0.25%(v/v);而后向上述測(cè)試液中分別加入20 μL SNAP-tag蛋白溶液(250 μmol/L的PBS溶液,20 mmol/L,pH 7.4)并反應(yīng)30 min后進(jìn)行吸收及熒光發(fā)射光譜測(cè)試。以上熒光光譜采集均選用440 nm激發(fā),狹縫為5-5;控制測(cè)試溫度為37 ℃。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及其熒光成像

細(xì)胞選用DMEM培養(yǎng)基(其中加入青霉素或者鏈霉素和10%胎牛血清(FBS))進(jìn)行培育。對(duì)對(duì)數(shù)期HeLa細(xì)胞進(jìn)行消化處理后接種于共聚焦專用皿(MatTek,半徑20 mm)中,于37 ℃、5% CO2下孵育24～48 h。而后將所需質(zhì)粒與Lip3000分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基中,混合5～10 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)皿,繼續(xù)孵育24～48 h后,取適量待測(cè)化合物母液加入培養(yǎng)基中(根據(jù)需要選擇合適終濃度)置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察(鏡頭選用100倍油鏡)。激光為405 nm,熒光采集為420～470 nm;激光為488 nm,熒光采集為500～550 nm;激光為561 nm,熒光采集為580～653 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的核磁共振表征

探針BGAN-Amino核磁氫譜數(shù)據(jù)為:1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.41 (s,1H),8.64 (d,J=8.3 Hz,1H),8.45 (d,J=6.8 Hz,de 1H),8.22 (d,J=8.4 Hz,1H),7.79 (s,1H),7.70～7.61 (m,1H),7.51 (s,2H),7.43 (d,J=8.1 Hz,2H),7.34 (d,J=8.1 Hz,2H),6.86 (d,J=8.4 Hz,1H),6.27 (s,2H),5.43 (s,2H),5.23 (s,2H)。

探針mBGAN-2C核磁氫譜數(shù)據(jù)為:1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.42 (s,1H),8.69 (t,J=15.8 Hz,1H),8.44 (d,J=7.2 Hz,1H),8.25 (dd,J=28.3,8.6 Hz,1H),7.78 (t,J=16.4 Hz,2H),7.66 (dd,J=17.9,9.8 Hz,1H),7.45 (d,J=27.3 Hz,1H),7.32 (dt,J=16.0,7.8 Hz,2H),6.77 (d,J=8.7 Hz,1H),6.28 (s,2H),5.44 (s,2H),5.24 (s,2H),3.43 (dd,J=11.6,5.9 Hz,2H),1.39～1.21 (m,3H)。

探針4BGAN-Bu核磁氫譜數(shù)據(jù)為:1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.42 (s,1H),8.78 (d,J=8.3 Hz,1H),8.52～8.46 (m,1H),8.46 (d,J=7.2 Hz,1H),8.18 (d,J=8.5 Hz,1H),7.83 (s,1H),7.76～7.67 (m,1H),7.49 (d,J=8.2 Hz,2H),7.43 (d,J=8.1 Hz,2H),6.67 (d,J=8.6 Hz,1H),6.27 (s,2H),5.45 (s,2H),4.68 (d,J=5.8 Hz,2H),4.05～3.96 (m,2H),1.57 (dt,J=14.8,7.5 Hz,2H),1.35～1.27 (m,2H),0.91 (t,J=7.3 Hz,3H)。

經(jīng)檢測(cè),以上核磁數(shù)據(jù)與各探針結(jié)構(gòu)相符,探針結(jié)構(gòu)正確。

2.2 探針對(duì)SNAP-tag標(biāo)簽蛋白的熒光響應(yīng)

圖4 不同SNAP-tag探針與蛋白結(jié)合前后的熒光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of different probes in the absence and presence of SNAP-tag

基于環(huán)境敏感的萘酰亞胺熒光團(tuán),在萘酰亞胺母體不同位置引入芐基鳥(niǎo)嘌呤基團(tuán),有望得到與SNAP-tag結(jié)合效果不同的熒光探針。通過(guò)萘酰亞胺內(nèi)酰胺引入芐基鳥(niǎo)嘌呤基團(tuán),并調(diào)節(jié)嘌呤在苯環(huán)的取代位置得到BGAN-Amino與mBGAN-2C;在萘酰亞胺4-位引入芐基鳥(niǎo)嘌呤基團(tuán)得到探針4BGAN-Bu。終濃度為5 μmol/L的BGAN-Amino、mBGAN-2C、4BGAN-Bu分別與5 μmol/L SNAP-tag蛋白結(jié)合后熒光信號(hào)均得到了增強(qiáng),但增強(qiáng)倍數(shù)不一(見(jiàn)圖4)。BGAN-Amino與SNAP-tag結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約9倍,而mBGAN-2C、4BGAN-Bu分別只有2倍與3倍。探針熒光強(qiáng)度的增加主要來(lái)源于SNAP-tag標(biāo)簽蛋白表面的疏水作用與熒光淬滅基團(tuán)鳥(niǎo)嘌呤的離去;熒光波長(zhǎng)的變化源于探針由水環(huán)境(20 mmol/L PBS,pH 7.4)到SNAP-tag標(biāo)簽蛋白疏水空腔的變化。相比于BGAN-Amino,mBGAN-2C與4BGAN-Bu熒光增強(qiáng)倍數(shù)少的原因?yàn)槎咴赑BS(磷酸緩沖液,20 mmol/L,pH 7.4)中熒光強(qiáng)度高,即熒光背景強(qiáng)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明本論文中的探針與SNAP-tag標(biāo)簽蛋白結(jié)合后,蛋白空腔或表面的疏水作用給萘酰亞胺母體帶來(lái)了較好的熒光增強(qiáng)效果,其能夠作為免洗的SNAP-tag探針用于生物原位成像及蛋白的原位分析中。4BGAN-Bu探針具有較好的細(xì)胞相容性及染色速度,因此該探針被進(jìn)一步用于活細(xì)胞內(nèi)蛋白的原位分析及熒光成像。

2.3 探針4BGAN-Bu在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)H2B蛋白的原位監(jiān)測(cè)

在體外4BGAN-Bu能夠?qū)NAP-rag蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別,且熒光得到明顯增強(qiáng),但其能否應(yīng)對(duì)復(fù)雜生物環(huán)境中特異標(biāo)記目標(biāo)蛋白仍需進(jìn)一步考究。首先,對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以表達(dá)融合有SNAP-tag的核內(nèi)蛋白H2B。終濃度1 μmol/L 的4BGAN-Bu細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃孵育HeLa細(xì)胞30 min后通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行熒光分析。圖5a表明4BGAN-Bu能對(duì)細(xì)胞核內(nèi)融合有SNAP-tag的H2B蛋白進(jìn)行染色,細(xì)胞核輪廓清晰,無(wú)需洗滌細(xì)胞。4BGAN-Bu標(biāo)記的H2B蛋白與商品化Hoechst 33342標(biāo)記的DNA結(jié)構(gòu)能夠很好重合(見(jiàn)圖5b、5c),這間接證明了H2B蛋白存在染色體內(nèi)并與DNA雙鏈有較強(qiáng)結(jié)合。此外,圖5d中對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分析表明,4BGAN-Bu對(duì)H2B染色的信噪比較高,具有很好的免洗熒光成像效果。

2.4 探針4BGAN-Bu在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)線粒體中Cox8A(細(xì)胞色素C氧化酶)的原位監(jiān)測(cè)

細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體內(nèi)電子傳遞鏈中的末端酶,其動(dòng)態(tài)分布、功能的行使與細(xì)胞的代謝密切相關(guān)。然而,由于時(shí)間分辨與空間分辨率的限制,質(zhì)譜、圓二色光譜等分析手段在原位監(jiān)測(cè)細(xì)胞色素C氧化酶的動(dòng)態(tài)行為上存在較大困難。而通過(guò)轉(zhuǎn)染融合有SNAP-tag蛋白的Cox8A,可以借助探針4BGAN-Bu達(dá)到對(duì)Cox8A的實(shí)時(shí)跟蹤。圖6a中標(biāo)記有4BGAN-Bu的Cox8A在線粒體中分布均勻,線粒體清晰可見(jiàn)且呈線條型(見(jiàn)圖6b)。圖6c-e表明,4BGAN-Bu與商業(yè)線粒體染料能夠?qū)崿F(xiàn)共定位,且SNAP-tag結(jié)合后有較高信噪比。4BGAN-Bu能夠在染色后直接用于對(duì)Cox8A的原位監(jiān)測(cè),避免反復(fù)洗滌細(xì)胞過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的細(xì)微損傷。

圖5 HeLa細(xì)胞的共聚焦成像圖Fig.5 Confocal images of HeLa cells a.Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu;b.Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye Hoechst 33342;c.Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and Hoechst 33342;d.Intensity profile of regions of interest (ROI)across HeLa cells.

圖6 HeLa細(xì)胞的共聚焦成像圖Fig.6 Confocal images of HeLa cells a,b.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu;c.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye MitoTracker Red;d.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and MitoTracker Red;e.intensity profile of regions of interest (ROI)across HeLa cells.

2.5 線粒體損傷過(guò)程中探針4BGAN-Bu對(duì)Cox8A(細(xì)胞色素C氧化酶)的原位監(jiān)測(cè)

借助探針4BGAN-Bu的免洗及高特異性,進(jìn)一步考察了線粒體受到損傷后線粒體形態(tài)變化及Cox8A分布變化(見(jiàn)圖7a)。高強(qiáng)度激光照射后,線粒體逐漸由線型(見(jiàn)圖6b)變?yōu)榘魻罨驁A形(見(jiàn)圖7b),而Cox8A仍然精準(zhǔn)定位線粒體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明,借助有機(jī)小分子探針4BGAN-Bu與SNAP-tag融合蛋白可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)不同狀態(tài)下的細(xì)胞色素C氧化酶Cox8A的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

圖7 損傷的HeLa細(xì)胞的共聚焦成像圖Fig.7 Confocal images of injured HeLa cells a,b.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu;c.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye MitoTracker Red;d.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and MitoTracker Red.

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)芐基鳥(niǎo)嘌呤基團(tuán)連接位置的改造設(shè)計(jì)了一系列基于萘酰亞胺的SNAP-tag探針,達(dá)到了對(duì)SNAP-tag不同的識(shí)別效果。該系列探針對(duì)融合有SNAP-tag的目標(biāo)蛋白進(jìn)行了特異性識(shí)別,其中BGAN-Amino與SNAP-tag結(jié)合后熒光增強(qiáng)了9倍,4BGAN-Bu具有較高反應(yīng)速率。此外,此系列SNAP-tag探針能夠針對(duì)目標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)的免洗熒光成像,對(duì)原位分析目標(biāo)蛋白的動(dòng)態(tài)變化及功能的行使具有重要意義。