趙雅夢,王 敏,張凌怡,魯譽(yù)浩,張維冰

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237)

全血直接離心得到的人血清中存在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、肽段等多種組分[1,2],是一種極其重要的生物樣品,廣泛用于疾病的檢測與診斷。其中,內(nèi)源性肽段參與了許多重要的生理病理進(jìn)程[3],是尋找疾病標(biāo)記物的重要來源。目前,質(zhì)譜是鑒定內(nèi)源性肽段的主要方法,但由于血清成分復(fù)雜,在鑒定中容易受到其他物質(zhì)的干擾。因此,在進(jìn)行質(zhì)譜分析前,對人血清進(jìn)行高效、高選擇性的預(yù)富集十分重要。目前,多種預(yù)富集方法已被用于人血清中內(nèi)源性肽段的富集,如溶劑沉淀法[4,5]、離心超濾法[6]、固相萃取法[7-9]等。

基于金屬有機(jī)框架(MOFs)的固相萃取材料具有MOFs材料有序的孔道、比表面積大和尺寸排阻效應(yīng)的特點,可以從復(fù)雜的生物樣品中富集低豐度的小分子肽段,同時排阻相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì),因此被廣泛應(yīng)用于高效分離富集多肽[10-14]。Zhao等[15]合成了一種表面修飾Zr-MOFs的磁性納米材料Fe3O4@PDA@Zr-MOF,并將其應(yīng)用于磷酸化肽段的富集。Xiong等[16]采用層層自組裝法制備得到了磁性介孔材料Fe3O4@MIL-100(Fe),并將其應(yīng)用于人血清中內(nèi)源性肽的富集。金屬框架有機(jī)物高溫煅燒得到的介孔碳材料,具有高度有序結(jié)構(gòu)、化學(xué)惰性及強(qiáng)疏水性的優(yōu)點,是一種良好的富集肽段的材料[17,18]。Sun等[19]以MOFs材料Co-ZIF-67為犧牲模板,合成了一種磁性納米多孔碳材料(NPC)。該材料具有強(qiáng)磁性、高比表面積、有序的介孔結(jié)構(gòu)以及高含碳量的特點,可以高效地富集生物樣品中的N-糖鏈。Li等[20]等高溫碳化Zn-MOFs,得到了具有高比表面積(1 700 m2/g)的碳材料,將其用于N-糖鏈的富集取得了良好的效果。Zhao等[21]高溫煅燒ZIF-67,得到了高度有序的介孔碳材料并將其用于內(nèi)源性肽段的富集,取得了較好的效果。

本文采用層層自組裝法制備得到了具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米材料Fe3O4@MIL-100(Fe),在氮氣保護(hù)下高溫煅燒,得到最終的磁性介孔碳材料Fe3O4@MC。該材料具有高碳含量,可以有效吸附內(nèi)源性肽段。此外,該材料具有超順磁性,可以實現(xiàn)材料與樣品的快速分離。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

4800plus型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS,美國AB Sciex公司);S3400型真空式掃描電子顯微鏡(SEM)、JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)(日本JEOL公司);Max2550VB/PC型X-射線衍射儀(日本Rigaku公司);APOLLO X型能譜儀(EDS,美國EDAX公司);TriStar II 3flex型氮氣吸附/脫附分析由全自動比表面及孔隙度分析儀(美國Micromeritics公司)。

1,3,5-苯三甲酸(H3Btc)、六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、無水乙酸鈉(NaAc)、巰基乙酸(MAA)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙二醇(EG)、乙醇(EtOH)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)購于上海凌峰試劑有限公司;尿素(urea)、碳酸氫銨(NH4HCO3)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胰蛋白酶(trypsin)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)均購于美國Sigma Aldrich公司。人血清由華東理工大學(xué)校醫(yī)院提供。

1.2 Fe3O4@MC的制備

稱取1.35 g FeCl3·6H2O和3.6 g NaAc,分散于75 mL EG中,攪拌30 min,將混合均勻的溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,于200 ℃反應(yīng)16 h,得到Fe3O4顆粒。

稱取400 mg Fe3O4顆粒,分散于60 mL EtOH中,隨后加入20 μL MAA,室溫攪拌24 h,得到Fe3O4@MAA。

稱取100 mg Fe3O4@MAA材料,分散于5 mL含10 mmol/L FeCl3·6H2O的EtOH溶液中,于室溫下超聲15 min,用EtOH清洗3次,除去未吸附的FeCl3·6H2O。將材料分散于5 mL含10 mmol/L H3Btc的EtOH溶液中,于70 ℃水浴加熱30 min,用EtOH清洗3次。上述步驟重復(fù)30次,得到Fe3O4@MIL-100(Fe)。

在氮氣保護(hù)下,將Fe3O4@MIL-100(Fe)材料置于管式爐中,于700 ℃反應(yīng)2 h,最終得到磁性納米材料Fe3O4@MC。

1.3 樣品前處理

稱取1.2 mg BSA,溶于1.2 mL含8 mol/L尿素和50 mmol/L NH4HCO3的水溶液中,加入24 μL 1 mol/L DTT,于60 ℃反應(yīng)1 h,加入8.6 mg IAA,于暗室反應(yīng)45 min,加入30 μg胰蛋白酶,于37 ℃下酶解16 h,分裝凍干,置于-20 ℃冰箱中備用。

量取10 μL人血清,加入90 μL超純水稀釋,煮沸5 min,以5 000 r/min離心10 min后,置于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 肽段/內(nèi)源性肽段富集流程

將0.5 mg Fe3O4@MC材料分散于400 μL超純水中,加入2 μL 1 μg/μL的BSA酶解液,將10 μL預(yù)處理的人血清或者0.5 μL 1 μg/μL的BSA酶解液與50 μg或200 μg的BSA混合,孵育30 min,磁鐵輔助下分離,棄除上清液,用超純水清洗材料。加入10 μL ACN-H2O-TFA洗脫液(80∶19.9∶0.1,v/v/v),孵育10 min,磁分離后收集洗脫液,洗脫過程重復(fù)兩次,將收集到的洗脫液用于后續(xù)MALDI-TOF MS分析。

1.5 質(zhì)譜分析

利用MALDI-TOF MS鑒定酶解液及人血清中多肽,脈沖激光波長設(shè)定355 nm,模式為反射正離子,采用摻釹釔鋁石榴石晶體(Nd/YAG)激光源。將0.5 μL洗脫液與0.5 μL 2,5-二羥基苯甲酸(DHB)基質(zhì)依次滴在樣品靶上,結(jié)晶后即可進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@MC的表征

通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC的形貌和結(jié)構(gòu)。如圖1所示,Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC均為球型結(jié)構(gòu),粒徑約為300 nm,MOFs層厚度約為20 nm。對比Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC的TEM圖可知,高溫煅燒后,材料的形貌和結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。

圖1 Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC的掃描電鏡圖和透射電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope(SEM)and transmission electron microscope(TEM)images of Fe3O4@MIL-100(Fe)and Fe3O4@MC

圖2 (a)Fe3O4@MC和(b)Fe3O4@MIL-100(Fe)的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction(XRD)spectra of(a)Fe3O4@MCand(b)Fe3O4@MIL-100(Fe)

采用EDS對Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC的元素組成和含量進(jìn)行分析。與Fe3O4@MIL-100(Fe)相比,Fe3O4@MC中碳含量由2.51%增加到6.79%(見圖S1,詳見http://www.chrom-China.com,下同),這主要是因為在氮氣保護(hù)下高溫煅燒,MIL-100(Fe)中有機(jī)組分發(fā)生碳化導(dǎo)致碳含量增加。

X-射線衍射儀用于表征材料的晶型結(jié)構(gòu)。如圖2所示,14.1°、18.2°和20.2°處出現(xiàn)的衍射峰是MOFs材料MIL-100(Fe)的特征峰,經(jīng)過高溫煅燒后,MIL-100(Fe)的衍射峰消失,23.6°出現(xiàn)的寬峰歸屬于石墨化碳的002晶面。說明經(jīng)過高溫煅燒,MIL-100(Fe)中的碳組分成功轉(zhuǎn)化為石墨化碳。

氮氣吸附/脫附儀用于測定Fe3O4@MIL-100(Fe)和Fe3O4@MC磁性納米材料的比表面積與孔徑分布。如圖S2a所示,Fe3O4@MIL-100(Fe)納米材料為Ⅳ型吸附脫附等溫線,計算得到該材料的比表面積為138.40 m2/g;孔徑分布如圖S2c所示,平均孔徑為4.24 nm。經(jīng)過高溫煅燒后,比表面積降為5.18 m2/g,Fe3O4@MC納米材料的粒徑分布如圖S2d所示,孔分布范圍較寬,平均孔徑為17.78 nm。推測Fe3O4@MC磁性納米材料呈現(xiàn)高爾夫狀大孔結(jié)構(gòu),高溫煅燒時MOFs結(jié)構(gòu)改變,形成了多種孔徑分布,可用于體積排阻的介孔數(shù)量明顯減少,隨之形成了一些較大的孔道,導(dǎo)致了比表面積下降。

2.2 Fe3O4@MC磁性納米材料用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶解液中肽段的富集

樣品酶解過程中由于加入的尿素、碳酸氫銨等無機(jī)鹽的干擾,直接對牛血清白蛋白酶解液進(jìn)行質(zhì)譜分析只檢測到了少量的肽段,且信號較低、信噪比很差(見圖3a)。經(jīng)Fe3O4@MC磁性納米材料的富集,檢測到33條高信號、高信噪比的肽段(見圖3b),肽段質(zhì)荷比、序列和位點見表S1。優(yōu)越的富集效率得益于Fe3O4@MC磁性納米材料的高碳含量?；谔冀M分與肽段間的強(qiáng)疏水相互作用,牛血清白蛋白酶解液中大部分肽段被Fe3O4@MC磁性納米材料吸附。

圖3 經(jīng)Fe3O4@MC富集(a)前、(b)后BSA酶解液的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of the bovine serumalbumin(BSA)digest(a)before and(b)afterenriching by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles* Peptides from BSA digest.

為了考察Fe3O4@MC磁性納米材料的選擇性,以牛血清白蛋白作為干擾物。當(dāng)BSA酶解液與BSA質(zhì)量比為1∶100時,直接分析BSA酶解液與BSA的混合溶液(見圖4a),由于高濃度蛋白質(zhì)的干擾,只檢測到12條肽段,且信號較弱,氨基酸序列為LGEYGFQNALIVR(m/z1 480.7 062)的肽段的信噪比(390.93)極低。經(jīng)Fe3O4@MC磁性納米材料富集后,檢測到26條肽段(見圖4b),氨基酸序列為LGEYGFQNALIVR(m/z1 480.7 062)的肽段的信噪比(1 168.43)明顯增強(qiáng)。當(dāng)酶解液與蛋白質(zhì)質(zhì)量比高達(dá)1∶400時,仍能檢測到25條高信號、高信噪比的肽段(見圖4c),所選肽段信噪比(1 029.29)基本保持不變。這一結(jié)果說明在高濃度蛋白質(zhì)的干擾下,Fe3O4@MC磁性納米材料仍可以高效、高選擇性地富集肽段。

圖4 不同比例的BSA酶解液與BSA混合物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of different mass ratios of BSA digest and BSA a.direct analysis,m(BSA digest∶BSA)=1∶100;b.enriched by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles,m(BSA digest∶BSA)=1∶100;c.enriched by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles,m(BSA digest∶BSA)=1∶400.

2.3 Fe3O4@MC納米材料用于人血清中內(nèi)源性肽段的富集

Fe3O4@MC磁性納米材料對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液中的肽段有著優(yōu)異的富集效果,因此,將其進(jìn)一步應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品人血清中內(nèi)源性肽段的富集。從圖5a可以看出,直接對人血清進(jìn)行質(zhì)譜分析,血清中存在的高豐度蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等組分嚴(yán)重干擾了內(nèi)源性肽段的檢測。因此,只檢測到少量內(nèi)源性肽段,且肽段信號峰的強(qiáng)度極弱。經(jīng)Fe3O4@MC磁性納米材料富集后,檢測到大量高信號、高信噪比的內(nèi)源性肽段(見圖5b),說明Fe3O4@MC磁性納米材料對于復(fù)雜的實際樣品有著較好的富集效果。

圖5 經(jīng)Fe3O4@MC磁性納米材料富集(a)前、(b)后人血清的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of human serum(a)before and(b)after enriching by Fe3O4@MC magnetic nanoparticles

3 結(jié)論

本文制備得到了高碳含量、大孔徑的磁性納米材料Fe3O4@MC?；谔疾牧吓c肽段間的強(qiáng)疏水作用及強(qiáng)磁性,Fe3O4@MC可以高效富集BSA酶解液中的33條特征肽段。此外，該材料對于復(fù)雜樣品人血清中內(nèi)源性肽段也具有較好的富集效果。Fe3O4@MC磁性碳材料的成功制備為多肽組學(xué)的

分離分析提供了更多的選擇。