禹 偉,高教琪,周雍進(jìn)

(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023)

微生物代謝工程通過(guò)改造或重構(gòu)微生物代謝途徑,使微生物利用廉價(jià)原料合成目的代謝產(chǎn)物,包括大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品、生物燃料和天然產(chǎn)物等[1-4]。然而,由于微生物在進(jìn)化過(guò)程中獲得了魯棒性強(qiáng)、調(diào)控緊密的代謝網(wǎng)絡(luò),制約著理性代謝工程改造[5]。近年來(lái),隨著DNA/RNA測(cè)序和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)策略的運(yùn)用使我們更容易獲取與細(xì)胞生理和代謝相關(guān)的生物“大數(shù)據(jù)”,這些數(shù)據(jù)為改造和優(yōu)化生產(chǎn)菌株提供重要線索。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在微生物代謝工程中的應(yīng)用Fig.1 Application of proteomics and metabolomics in microbial metabolic engineering

蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D SDS-PAGE)和質(zhì)譜等技術(shù),大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化研究某一生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其特征,包括蛋白質(zhì)表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用等。蛋白質(zhì)組學(xué)除了能夠提供定量的數(shù)據(jù)以外,還能提供包括蛋白質(zhì)定位和修飾的定性信息,因此對(duì)深入理解生物代謝具有重要作用[6]。而代謝組學(xué)則運(yùn)用質(zhì)譜、核磁共振、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù),對(duì)某一生物在特定生理時(shí)期內(nèi)所有相對(duì)分子質(zhì)量較低(<1 000)的代謝物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析。由此可見(jiàn),質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,而關(guān)于質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展已有詳細(xì)綜述[7],在此不再贅述。轉(zhuǎn)錄組主要測(cè)定生物體內(nèi)各基因的轉(zhuǎn)錄水平,由于轉(zhuǎn)錄水平受多方面因素的調(diào)控,如底物濃度、誘導(dǎo)劑濃度、抑制劑濃度等,測(cè)定的基因轉(zhuǎn)錄水平很難直接預(yù)測(cè)表型,因此蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)相對(duì)于轉(zhuǎn)錄組而言,對(duì)于生物表型的鑒定或預(yù)測(cè)更加直觀可靠。需要強(qiáng)調(diào)的是,蛋白質(zhì)(尤其是酶)的含量并不一定與其酶活力相匹配,而代謝組學(xué)能夠直接測(cè)定特定條件下的代謝物水平以及代謝流向,因而可以與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相互補(bǔ)充。目前廣泛使用的基因組尺度代謝模型(genome scale metabolic model,簡(jiǎn)稱(chēng)GEM),就是整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝流組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,GEM從全局角度理解代謝功能,通過(guò)測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平、代謝物種類(lèi),不僅可以預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)表型,還能指導(dǎo)系統(tǒng)代謝工程改造[8]。

除了整合多組學(xué)策略進(jìn)行系統(tǒng)代謝工程,單獨(dú)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)或代謝組學(xué)也可以指導(dǎo)微生物代謝工程改造。蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析微生物體內(nèi)全部蛋白質(zhì)(酶)的含量,通過(guò)比較不同條件下酶的相對(duì)表達(dá)水平,尋找需要優(yōu)化表達(dá)水平的酶作為代謝工程靶點(diǎn),以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量[9]。而代謝組學(xué)通過(guò)分析菌株不同條件下代謝物含量的變化,可以指導(dǎo)菌株高效合成目的產(chǎn)物,提高菌株對(duì)產(chǎn)物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性,預(yù)測(cè)限速步驟等[10-12]。另外,蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合,還可以挖掘植物次級(jí)代謝途徑,促進(jìn)微生物代謝工程合成更豐富的天然產(chǎn)物[13]。本文重點(diǎn)對(duì)近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在微生物代謝工程中的應(yīng)用(見(jiàn)圖1)進(jìn)行綜述和展望。

1 多組學(xué)與代謝工程

GEM以基因組學(xué)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),整合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù),描述微生物體內(nèi)所有代謝反應(yīng)、催化反應(yīng)的酶以及酶的編碼基因三者間的相互關(guān)系(見(jiàn)圖2),已經(jīng)成為系統(tǒng)研究微生物代謝的重要工具[14]。GEM模擬代謝過(guò)程,對(duì)于特定目的產(chǎn)物,提出潛在菌種改造策略,例如敲除或弱化競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑、過(guò)表達(dá)目的代謝途徑的關(guān)鍵酶、改變代謝流方向等,從而提高目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[15]。

圖2 基因組尺度代謝模型的構(gòu)建流程Fig.2 Construction procedure of genome scale metabolic model

光滑球擬酵母(Candidaglabrata)是一種高產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)微生物,為了深入理解該菌種的生理和細(xì)胞代謝,Xu等[16]構(gòu)建了C.glabrata的GEM,該模型包含804個(gè)基因、1 287個(gè)代謝反應(yīng)和1 025種代謝物,分析確定了高產(chǎn)丙酮酸的原因,包括高效的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、3條丙酮酸合成途徑,以及吡哆醛、硫胺素、煙酸和生物素合成關(guān)鍵步驟的缺失;在此模型預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上,提出其他目標(biāo)產(chǎn)物代謝工程策略:(1)抑制α-酮戊二酸脫氫酶的活性,增加硫胺素的添加量,提高線粒體中ATP的水平,進(jìn)一步增加了α-酮戊二酸的產(chǎn)量;(2)過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶基因,提高糖酵解和細(xì)胞質(zhì)還原途徑的流量,實(shí)現(xiàn)了5.4 g/L富馬酸的積累;(3)過(guò)表達(dá)α-乙酰乳酸脫羧酶(催化丙酮酸裂解形成乙偶姻),實(shí)現(xiàn)了1.2 g/L乙偶姻的積累。該研究證明了GEM策略用于簡(jiǎn)化代謝工程靶點(diǎn)的通用性。

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris,最新命名Komagataellaphaffii)由于其高效的甲醇誘導(dǎo)型醇氧化酶強(qiáng)啟動(dòng)子,廣泛用于異源蛋白質(zhì)表達(dá)[17]。Ye等[18]在最新的基因組注釋和文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,構(gòu)建了全新的P.pastoris的代謝模型iRY1243,新模型包含2 407個(gè)代謝反應(yīng)、1 094種代謝物、1 243個(gè)基因。運(yùn)用該模型,作者成功預(yù)測(cè)了在葡萄糖為碳源的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)的123個(gè)生長(zhǎng)必需基因,這些基因與輔因子代謝、三羧酸循環(huán)、脂類(lèi)合成有關(guān)。另外,模型預(yù)測(cè)敲除甲醇氧化酶編碼基因aox1、腺苷甲硫氨酸脫羧酶編碼基因spe2、胱硫醚β-合成酶編碼基因cys4、插入鏈霉殺陽(yáng)菌素裂解酶編碼基因vgb,以及過(guò)表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf1、甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶編碼基因sam2,可增加S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的產(chǎn)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)一致,說(shuō)明該模型具有指導(dǎo)畢赤酵母代謝工程改造的應(yīng)用前景。

解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一種模式產(chǎn)油酵母,胞內(nèi)最多可積累自身干重50%的油脂,而油脂可用于生產(chǎn)高品質(zhì)生物柴油[19]。Pan等[20]結(jié)合基因組注釋和代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息,構(gòu)建了Y.lipolytica的基因組尺度代謝模型iYL619_PCP,其中包含619個(gè)基因、843種代謝物和1 142個(gè)生化反應(yīng);該模型成功預(yù)測(cè)了Y.lipolytica的最小成分培養(yǎng)基以及在不同底物上的生長(zhǎng)能力,利用代謝流平衡分析模擬單基因敲除過(guò)程,預(yù)測(cè)了模型的必需基因和半必需基因;另外,在該模型的基礎(chǔ)上通過(guò)代謝組學(xué)進(jìn)行代謝流擾動(dòng)分析,得出乙酰-輔酶A(CoA)羧化酶是提高油脂合成的關(guān)鍵酶,以及2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的兩個(gè)酶編碼基因的敲除可增加絲氨酸的合成。

目前,大量相繼報(bào)道的組學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)被用于構(gòu)建更豐富的微生物GEM,這必將在預(yù)測(cè)微生物表型和指導(dǎo)代謝工程等方面做出重要貢獻(xiàn)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)指導(dǎo)菌株生物合成

運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析不同表型和基因型的菌株,探究菌株生產(chǎn)與酶水平、代謝物水平之間的關(guān)聯(lián),確定菌株改造靶點(diǎn),可以指導(dǎo)菌株生物的合成。

Alonso-Gutierrez等[9]報(bào)道了一種定量靶向蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法:蛋白質(zhì)組主成分分析(PCAP)。研究人員[9]將甲羥戊酸(MVA)途徑的9個(gè)基因分成3個(gè)基因簇,并分別通過(guò)單質(zhì)粒和雙質(zhì)粒表達(dá)的排列組合,構(gòu)建了27株大腸桿菌(Escherichiacoli)工程菌,然后分析各菌株產(chǎn)量與MVA途徑酶水平的關(guān)聯(lián),得出萜類(lèi)合成酶的過(guò)表達(dá)和其他酶的平衡表達(dá)使檸檬烯產(chǎn)量提高40%,而且將該策略應(yīng)用于生物燃料-甜沒(méi)藥烯的合成,產(chǎn)量達(dá)到最高報(bào)道值(1 150 mg/L),相比之前報(bào)道的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)[21],產(chǎn)量提高2倍以上。

Redding-Johanson等[22]報(bào)道了另一種靶向蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法:選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)質(zhì)譜。研究人員[22]通過(guò)SRM技術(shù)發(fā)現(xiàn),由9個(gè)基因組成的紫穗槐二烯合成途徑中蛋白表達(dá)量的增加直接促進(jìn)產(chǎn)量的增加;由于該途徑中來(lái)源于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羥戊酸激酶(MK)和磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)在SRM檢測(cè)中幾乎沒(méi)有表達(dá),推測(cè)是轉(zhuǎn)錄水平低導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)困難,而經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后由強(qiáng)啟動(dòng)子控制MK和PMK基因的表達(dá),使蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯提高,產(chǎn)物紫穗槐二烯的產(chǎn)量提高了3倍。

除了蛋白質(zhì)組學(xué)指導(dǎo)菌株代謝工程改造外,代謝組學(xué)通過(guò)測(cè)定工程菌改造前后的代謝物變化,也可以為進(jìn)一步代謝途徑優(yōu)化提供潛在的改造靶點(diǎn)。Gold等[10]使用靶向代謝組學(xué)評(píng)估代謝工程策略,以提高S.cerevisiae中L-酪氨酸的產(chǎn)量,通過(guò)定向測(cè)定不同改造菌株中心碳代謝途徑和酪氨酸合成途徑的葡萄糖、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、赤蘚糖-4-磷酸、脫氫莽草酸、預(yù)苯酸、酪氨酸以及香豆酸等代謝物比濃度的時(shí)間變化,最終確定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Zwf1、環(huán)己二烯脫氫酶TyrC、反饋抑制耐受性3-脫氧-7-磷酸景天庚酮糖合成酶Aro4為重要的代謝調(diào)控點(diǎn),敲除ZWF1、過(guò)表達(dá)TYRC以及解除果糖-1,6-二磷酸對(duì)3-脫氧-7-磷酸景天庚酮糖合成酶的抑制的ARO4FBR基因后,酪氨酸產(chǎn)量相比原始菌株提高384倍,達(dá)到520 μmol/g DCW。

綜上,蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)指導(dǎo)菌株生物合成的主要策略是,通過(guò)檢測(cè)代謝物水平或酶蛋白質(zhì)表達(dá)水平,確定與生物合成相關(guān)的代謝途徑調(diào)控靶點(diǎn),然后通過(guò)基因工程改造相應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,最終通過(guò)多策略結(jié)合實(shí)現(xiàn)菌株生物合成的改善。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)指導(dǎo)菌株耐受性改造

以微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)生物能源,如乙醇、丁醇等,可部分替代石油基運(yùn)輸燃料,被認(rèn)為是可持續(xù)、環(huán)境友好型生物制造過(guò)程[23]。然而,這些低碳醇類(lèi)對(duì)微生物具有一定的毒害作用,因此提高產(chǎn)物耐受性非常重要,可提高菌株生長(zhǎng)能力以及目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量[24]。由于耐受性受多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制調(diào)控[25],因此難以獲得特異的耐受性調(diào)控靶點(diǎn)。而代謝組學(xué)可以測(cè)定不同菌株在不同條件下的代謝物水平,尋找與菌株耐受性相關(guān)的代謝物及相應(yīng)的改造位點(diǎn);蛋白質(zhì)組學(xué)可以比較不同耐受性菌株的差異表達(dá)蛋白質(zhì),尋找與耐受性相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為菌株耐受性改造提供指導(dǎo)(見(jiàn)表1)。

Hasunuma等[11]構(gòu)建了一株利用木糖的S.cerevisiae工程菌,借助基于毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)方法,測(cè)定不同乙酸濃度下的胞內(nèi)代謝物水平,研究乙酸對(duì)菌株木糖發(fā)酵的影響;代謝組學(xué)分析表明,在添加乙酸后非氧化磷酸戊糖(PPP)途徑的代謝物-7-磷酸景天庚酮糖、5-磷酸核酮糖、5-磷酸核糖和4-磷酸赤蘚糖顯著積累,說(shuō)明乙酸減慢了PPP途徑的下游代謝步驟;在此信息指導(dǎo)下,過(guò)表達(dá)磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)酮酶基因TKL1和轉(zhuǎn)醛酶基因TAL1,顯著提高了菌株對(duì)乙酸的耐受性,工程菌株在60 mmol/L乙酸存在下乙醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高9.47倍。Teoh等[26]應(yīng)用一種基于代謝組學(xué)的半理性策略提高S.cerevisiae對(duì)1-丁醇的耐受性,借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用非靶向代謝組學(xué),測(cè)定不同丁醇耐受性的19株單基因敲除菌株的代謝物指紋圖譜,并建立代謝物豐度與脅迫生長(zhǎng)速率之間的回歸模型;模型分析得出,蘇氨酸濃度與菌株生長(zhǎng)顯著正相關(guān),而檸檬酸濃度與菌株生長(zhǎng)顯著負(fù)相關(guān),因此提出菌株改造的策略為增加蘇氨酸積累量、減少檸檬酸積累量。與出發(fā)菌株相比,工程菌株在丁醇脅迫條件下比生長(zhǎng)速率更高,即提高了菌株對(duì)丁醇的耐受性。Ohta等[27]運(yùn)用同樣的策略,檢測(cè)出與S.cerevisiae乙醇耐受性相關(guān)的化合物,如纈氨酸、肌醇等,因此這兩種代謝物被認(rèn)為是潛在的改造目標(biāo),經(jīng)過(guò)代謝工程改造增加纈氨酸的積累、加強(qiáng)肌醇的還原,最終顯著提高菌株對(duì)乙醇的耐受性。

表1 蛋白質(zhì)學(xué)和代謝組學(xué)指導(dǎo)菌株耐受性改造Table1 Guidance of microbial stress tolerance engineering by proteomics and metabolomics

2DE:two-dimensional electrophoresis;iTRAQ:isobaric tags for relative and absolute quantitation.

Mao等[32]運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析野生型和高丁醇耐受性丙酮丁醇羧菌(Clostridiumacetobutylicum)在產(chǎn)酸階段和產(chǎn)溶劑階段的差異表達(dá)蛋白質(zhì);等級(jí)聚類(lèi)分析表明,在丁醇耐受菌株中伴侶蛋白質(zhì)和產(chǎn)溶劑相關(guān)蛋白質(zhì)在兩階段都上調(diào),而氨基酸代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白質(zhì)都下調(diào);這一結(jié)果闡述了C.acetobutylicum的丁醇耐受性機(jī)制,為丁醇耐受性改造提供了潛在的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)。Jia等[33]通過(guò)基因組比對(duì)得到了與丁醇耐受性相關(guān)的雙功能未知基因SMB_G1518-1519,敲除該基因提高了C.acetobutylicum的丁醇耐受性;為進(jìn)一步分析耐受性提高的機(jī)制,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)比較基因敲除菌株與原始菌株,發(fā)現(xiàn)與碳代謝、細(xì)胞流動(dòng)、伴侶蛋白質(zhì)和脂肪酸合成相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量都增加2倍以上,證明SMB_G1518-1519是丁醇耐受性的負(fù)調(diào)控因子。

4 代謝組學(xué)預(yù)測(cè)限速步驟

代謝途徑一般由多步酶促反應(yīng)組成,但往往這些酶催化效率很難完全協(xié)調(diào)匹配,其中酶催化效率較低的反應(yīng)便成為限制該代謝途徑的瓶頸,即限速步驟。代謝工程優(yōu)化細(xì)胞生產(chǎn)性能的一般策略,是在首輪改造后鑒定限速步驟,對(duì)限速步驟進(jìn)行下一輪改造[36]。因此,鑒定限速步驟是改造中的重要環(huán)節(jié)。代謝組學(xué)可以通過(guò)定量分析胞內(nèi)代謝物濃度,尋找濃度明顯差異的代謝物,進(jìn)而鑒定代謝途徑的限速步驟(見(jiàn)圖3)。

藍(lán)藻(Synechocystissp.)可以通過(guò)光合作用利用CO2生產(chǎn)燃料和化學(xué)品。Noguchi等[12]在藍(lán)藻中引入來(lái)源于梭菌的CoA途徑,改造后的菌株可以使CO2轉(zhuǎn)化為1-丁醇。為了優(yōu)化CoA途徑,研究人員[12]使用離子對(duì)液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜,以13C標(biāo)記的藍(lán)藻細(xì)胞提取物為內(nèi)標(biāo),測(cè)定胞內(nèi)各代謝物的水平,結(jié)果分析表明丁酰-CoA還原為丁醇的反應(yīng)是該途徑的限速步驟,優(yōu)化該反應(yīng)后不僅增加丁醇的產(chǎn)量,還提高了胞內(nèi)乙酰-CoA和丙二酰-CoA含量,從而驗(yàn)證了丁酰-CoA還原反應(yīng)為限速步驟的推測(cè)。

圖3 代謝組學(xué)預(yù)測(cè)代謝途徑限速步驟Fig.3 Prediction of rate-limiting steps in metabolic pathway via metabolomics

Tamakawa等[37]構(gòu)建了一株能夠利用木糖產(chǎn)乙醇的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis),但乙醇產(chǎn)量較低,因此利用CE-TOF MS對(duì)菌株全局代謝物進(jìn)行代謝組學(xué)分析,結(jié)果表明木糖發(fā)酵菌株相比原始菌株積累較多的磷酸戊糖途徑中間代謝物、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和3-磷酸甘油醛上游的糖酵解代謝物,由于磷酸戊糖途徑的上游木糖利用和糖酵解途徑都與NADH有關(guān),推測(cè)高比例的NADH/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是木糖產(chǎn)乙醇的限速步驟;因此過(guò)表達(dá)了NADH依賴型的醇脫氫酶ADH1,該酶在催化乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇的同時(shí)將NADH轉(zhuǎn)化為NAD+,使乙醇產(chǎn)量增加了17%。

Hasunuma等[38]利用藍(lán)藻生產(chǎn)琥珀酸,通過(guò)CE-MS代謝組學(xué)測(cè)定菌株在黑暗厭氧條件下還原三羧酸途徑生產(chǎn)琥珀酸的13C標(biāo)記代謝物的動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)與磷酸烯醇式丙酮酸和乙酰-CoA相比,下游檸檬酸、蘋(píng)果酸、延胡索酸和琥珀酸增加速度慢,推測(cè)催化丙酮酸生成草酰乙酸的丙酮酸羧化酶可能是一個(gè)限速酶;通過(guò)過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶基因以及供應(yīng)碳酸鹽,顯著提高了琥珀酸的產(chǎn)量(由120 mg/L提高到192 mg/L,提高60%)。

5 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)用于植物次級(jí)代謝途徑的挖掘

圖4 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)挖掘植物次級(jí)代謝途徑Fig.4 Excavation of plant secondary metabolic pathway via proteomics and metabolomics 2D SDS-PAGE:two-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis;PCA:principal component analysis;PCC:pearson correlation coefficient;HCA:hierarchical cluster analysis;BL-SOM:batch-learning self-organizing map.

次級(jí)代謝產(chǎn)物是在生命周期或形態(tài)分化的特定時(shí)期產(chǎn)生的低相對(duì)分子質(zhì)量的活性物質(zhì)的總稱(chēng)。植物次級(jí)代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁雜,可廣泛用于食品添加劑、香料、殺蟲(chóng)劑、色素和生物燃料等。而通過(guò)植物本身生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物面臨產(chǎn)量低、分離成本高、規(guī)模放大困難等挑戰(zhàn)。因此,微生物合成植物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有一定應(yīng)用前景,例如在微生物中構(gòu)建青蒿素前體青蒿酸的生物合成途徑能顯著提高青蒿素的產(chǎn)量[39]。次級(jí)代謝產(chǎn)物微生物合成需要清晰的合成途徑相關(guān)基因原件,而蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展加速了對(duì)次級(jí)代謝途徑的闡述和解析。使用多組學(xué)方法可以發(fā)現(xiàn)植物次級(jí)代謝新基因,從全局水平理解基因功能,并在此基礎(chǔ)上挖掘新的次級(jí)代謝途徑,為微生物代謝工程合成天然產(chǎn)物提供重要理論依據(jù)(見(jiàn)圖4)。

次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與調(diào)控受多個(gè)基因的控制,鑒定這些基因是揭示次級(jí)代謝的首要任務(wù)。蛋白質(zhì)組學(xué)可以鑒定植物次級(jí)代謝的酶和調(diào)控蛋白質(zhì),根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)序列同源性比對(duì)找到相應(yīng)的基因。例如,Decker等[40]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析了富含罌粟的蛋白質(zhì)乳液中75個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),其中69個(gè)蛋白質(zhì)通過(guò)與已知蛋白質(zhì)同源比對(duì)確定其功能,最終鑒定出參與嗎啡生物合成的關(guān)鍵酶:可待因酮還原酶。Lei等[41]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析模式豆類(lèi)蒺藜狀苜蓿細(xì)胞懸液的蛋白質(zhì)組分,鑒定和定量檢測(cè)1 367個(gè)蛋白質(zhì),其中約5%的蛋白質(zhì)與次級(jí)代謝相關(guān),包括與黃酮/異黃酮、查爾酮代謝相關(guān)的酶。

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái),植物基因組測(cè)序積累了海量的基因信息,但如何注釋這些基因的功能仍面臨一定挑戰(zhàn)。代謝組學(xué)是聯(lián)系基因型和表型的紐帶,但代謝物與基因之間并不總具有直接聯(lián)系。為解決這一問(wèn)題,Raamsdonk等[42]基于代謝物的相關(guān)變化能反映沉默基因的作用位點(diǎn)這一思想,推測(cè)相似的基因?qū)е孪嗨频拇x物變化,而未知功能的基因可通過(guò)代謝物比較來(lái)鑒定,據(jù)此發(fā)明了一種利用比較代謝組學(xué)測(cè)定代謝物變化來(lái)鑒定未知基因功能的方法。鑒定新基因的另一策略是非靶向轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析,這一策略利用batch-learning self-organizing gene mapping策略把受同一機(jī)制調(diào)控的一系列代謝物和基因聚為一類(lèi),該方法將3個(gè)未表征的潛在的磺基轉(zhuǎn)移酶基因鑒定為芥子油苷生物合成基因,而重組基因體外酶活測(cè)試也證明了這3個(gè)基因?yàn)槊摶墙孀佑蛙栈腔D(zhuǎn)移酶,驗(yàn)證了該策略的效果[43]。

萜類(lèi)化合物是種類(lèi)多樣的天然產(chǎn)物,已發(fā)現(xiàn)的萜類(lèi)生物合成途徑有兩種:甲醛戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑[44]。雖然上游代謝途徑的基因非常保守,但大多數(shù)萜類(lèi)物質(zhì)下游合成途徑及關(guān)鍵的合成酶基因都是未知的,成為其微生物合成的限制因素。Farag等[45]運(yùn)用代謝組學(xué)研究蒺藜狀苜蓿中一個(gè)新的異黃酮生物合成途徑,通過(guò)高效液相色譜-離子肼色譜分析響應(yīng)酵母粉誘導(dǎo)的苜蓿細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物胞內(nèi)和胞外次級(jí)代謝物的組分,發(fā)現(xiàn)3種新的甲基化異黃酮,同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明前兩種異黃酮均來(lái)源于芒柄花黃素,標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和相關(guān)性分析最終揭示了這兩種異黃酮的生物合成途徑。另外,非靶向代謝組學(xué)是一種檢測(cè)未知途徑新代謝物的高通量方法。Keurentjes等[46]應(yīng)用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定了不同來(lái)源擬南芥的代謝物,比較分析并發(fā)現(xiàn)了一些未知代謝途徑,再通過(guò)定量特性位點(diǎn)分析得到了一個(gè)新的脂肪族芥子油苷生物合成途徑網(wǎng)絡(luò)。

6 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在微生物代謝工程中的應(yīng)用,特別介紹了整合多組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建基因組尺度代謝模型、菌株生物合成優(yōu)化、菌株耐受性改造以及代謝途徑限速步驟預(yù)測(cè)的成功案例。除此之外,蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)能加快植物次級(jí)代謝途徑挖掘,為微生物合成天然產(chǎn)物提供新酶基因。

雖然研究報(bào)道了越來(lái)越多的微生物代謝模型,目前代謝模型在線預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高。例如自動(dòng)化構(gòu)建的模型一般都是粗模型,缺乏細(xì)胞酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和相關(guān)調(diào)控機(jī)制,因而只能反映代謝特征而不能精確定量模擬。因此,需要整合更多的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、流量組學(xué)、調(diào)控組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)以及代謝酶催化速率,進(jìn)一步提高模型準(zhǔn)確性和精確度。目前,研究人員關(guān)于微生物生理和代謝相關(guān)的多組學(xué)數(shù)據(jù)通常都是發(fā)表在各自的論文中,缺乏系統(tǒng)性的收集和整理,人工匯集這些珍貴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)又相當(dāng)困難。然而,隨著生物“大數(shù)據(jù)”的不斷積累和人工智能的日益發(fā)展,如果研究人員將各自分散的多組學(xué)數(shù)據(jù)匯聚于統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫(kù),運(yùn)用數(shù)據(jù)科學(xué)和人工智能的策略對(duì)多樣化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理,不斷更新和修正已有的系統(tǒng)生物學(xué)信息,有望更好地指導(dǎo)微生物代謝工程,從而高效合成更多重要化學(xué)品。