馬斯禹，阮雯聰，曹宗富，李海峰，沈玥，蔡瑞琨，陸超，羅敏娜，馬旭，高華方，4*，鄒艷

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，杭州 310003；4.國家人類遺傳資源中心，北京 102206；5.浙江省疾病預(yù)防控制中心，杭州 310051)

Joubert綜合征(Joubert Syndrome，MIM#213300)因Joubert等[1]于1969年首次報道而得名，是一種以小腦蚓部發(fā)育不良為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要的臨床表現(xiàn)包括陣發(fā)性呼吸急促、眼球運(yùn)動障礙、肌張力減低、共濟(jì)失調(diào)等，亦可合并視網(wǎng)膜、腎臟、肝臟、骨骼等多器官受累[2-3]，其主要的影像學(xué)特征為小腦蚓部部分或完全缺如、小腦上腳增粗和“磨牙征”(molar tooth sign，MTS)[4]。Joubert綜合征通常表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，僅Joubert綜合征10型表現(xiàn)為X連鎖隱性遺傳(OFD1)。該病在不同人群的發(fā)病率不一，目前缺乏中國的發(fā)病率的數(shù)據(jù)。Joubert綜合征具有明顯的遺傳異質(zhì)性，超過34個基因被發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)[5-9]。其中Joubert綜合征4型是因NPHP1突變導(dǎo)致的，患兒通常伴有腎臟損害的并發(fā)癥風(fēng)險。2015年，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院康復(fù)科收治一例發(fā)育遲緩，磁共振顯示“磨牙征”、疑似Joubert綜合征的患兒，通過二代測序和MLPA等技術(shù)，明確為NPHP1純合缺失引起的Joubert綜合征，現(xiàn)將該患兒的臨床特點及遺傳學(xué)分析結(jié)果報道如下。

材料和方法

一、實驗材料

本研究Joubert綜合征患者來自于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院康復(fù)科。經(jīng)國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會批準(zhǔn)，在知情同意的前提下，收集了患兒的臨床資料，并采集患兒及其父母的靜脈血進(jìn)行基因檢測。正常人的血樣(用于MLPA實驗)取自國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所門診部。

全血基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen公司(德國)；Taq酶、DNA marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增引物由華大六合科技有限公司合成；MLPA探針(SALSA MLPA P387NPHP1 probemix)及試劑盒(SALSA MLPA EK1-FAM reagent kit)為MRC-Holland公司(荷蘭)產(chǎn)品。

二、DNA提取和全外顯子組測序

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)的操作說明從全血中提取基因組DNA，Qubit3.0(Invitrogen，美國)定量。取0.5 μg待測樣品DNA用Covaris 超聲儀(Covaris，美國)隨機(jī)打斷成180～280 bp的片段，用SureSelect Human All Exon V6(60 Mb) kit (Agilent，美國)進(jìn)行建庫和全外顯子組捕獲，在NovaSeq 6000測序儀上(Illumina，美國)進(jìn)行2×150雙端測序。測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

三、測序數(shù)據(jù)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制，去除污染的、低質(zhì)量的reads后得到clean data，通過以下幾個步驟進(jìn)行分析：(1)以GRCh37/hg19基因組作為參考基因組，應(yīng)用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件、Picard 軟件和Genome Analysis Toolkit (GATK)軟件對所有的SNP、InDel位點進(jìn)行比對、分析，利用Ensembl Variant Effect Predictor對變異位點進(jìn)行注釋；(2)去除內(nèi)含子區(qū)突變和同義突變；(3)去除dbSNP151數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、gnomAD數(shù)據(jù)庫(http：//gnomad.broadinstitute.org)等公共數(shù)據(jù)庫中MAF≥1%的突變；(4)優(yōu)先分析已知的Joubert綜合征致病基因，篩選無義突變、移碼突變、剪接位點突變、終止密碼子丟失等對蛋白質(zhì)功能影響較大的變異位點，按照ACMG的指南進(jìn)行變異位點的解讀；(5)利用GATK軟件計算已知Joubert綜合征致病基因的平均測序深度，進(jìn)行拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)的分析；(6)利用IGV軟件查看二代測序的結(jié)果。

四、Sanger測序驗證及突變功能分析

根據(jù)全外顯子變異位點的分析結(jié)果，獲得候選致病基因AHI1，針對其編碼區(qū)所在的第4～29號外顯子區(qū)域設(shè)計引物(表1)，以患兒及其父母的基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，所得產(chǎn)物用于ABI 3730xl(美國)的Sanger測序。使用Chromas軟件查看Sanger 測序峰圖，用SeqMan 軟件比對測序結(jié)果。

五、多重連接探針擴(kuò)增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA)

根據(jù)全外顯子組平均測序深度的分析結(jié)果提示，利用多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)技術(shù)對患兒及其父母的NPHP1基因進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測，同時用正常人的DNA進(jìn)行對照實驗。具體操作步驟如下：(1)DNA變性：取100 μg DNA(5 μl)于98℃加熱5 min；(2)雜交：加入3 μl SALSA探針混合物和1.5 μl MLPA緩沖液，95℃溫浴1 min，60℃雜交16 h；(3)連接：加入32 μl連接酶混合液，54℃溫浴15 min。再于98℃加熱5 min使連接酶失活；(4)加入2 μl PCR混合物、0.5 μl聚合酶，開始PCR擴(kuò)增；(5)毛細(xì)管電泳：將所得產(chǎn)物經(jīng)86℃變性3 min以后，取0.7 μl產(chǎn)物混合0.2 μl LIZ500，在ABI 3730xl(美國)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。利用Coffalyser.NET軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、臨床資料

患兒，男，因“6月齡豎頭欠穩(wěn)”就診?；純合档?胎第1產(chǎn)，其母產(chǎn)前孕檢MRI顯示胎兒后顱窩池增大、小腦下蚓部發(fā)育欠佳。足月剖宮產(chǎn)，患兒出生時體重3 kg，身長48 cm，出生后窒息，2 h即入院，9 d后痊愈出院。

查體顯示：患兒左眼內(nèi)斜，追聲能引出，追視欠靈活，逗引會笑，豎頭欠穩(wěn)，不會翻身，雙手握拳，無主動抓物意識，雙下肢負(fù)重差，四肢肌力IV級，肌張力偏低。輔助檢查：肝臟、膽囊、脾臟、胰臟、雙腎、輸尿管及膀胱超聲檢查未見異常。顱腦 MRI：軸位T1W1示小腦蚓部小，中腦變形呈“磨牙”狀(圖1)，第四腦室上部呈“蝙蝠翼”。診斷：Joubert綜合征。

后隨訪至今：該患兒1歲能獨坐，2歲4個月能走?，F(xiàn)年4歲4個月，身高104 cm，體重17 kg，能簡單交流，獨立上下樓梯、穿脫衣物，手眼協(xié)調(diào)欠佳。

A：軸位T1W1顯示小腦蚓部發(fā)育小和“磨牙征”；B：矢狀位T1W1顯示小腦上腳抬高增粗圖1 患兒頭部MRI影像圖

二、全外顯子組測序及變異位點分析結(jié)果

全外顯子組測序產(chǎn)出Raw data 為19.19 G，clean data為18.75 G，總reads數(shù)為127 906 426條，Q30為95.62%?？偛东@效率為83.03%，目標(biāo)捕獲區(qū)平均測序深度為160×，其中≥1×測序深度下的覆蓋度為98.23%，≥10×測序深度下的覆蓋度為97.79%，≥20×測序深度下的覆蓋度為97.41%，數(shù)據(jù)量符合分析要求。

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過比對、注釋、過濾、篩選以后，在6號染色體的AHI1基因(NM_001134831.1)上的第7號外顯子發(fā)現(xiàn)1個雜合的缺失突變，c.533_534delAA，p.Glu178GlyfsTer3。該位點因在533和534處連續(xù)缺失兩個堿基，造成第178位的谷氨酸改變?yōu)楦拾彼幔⒃斐山K止密碼子提前，形成截短翻譯的蛋白。該變異位點在dbSNP數(shù)據(jù)庫中的編號為rs759593846，ExAC數(shù)據(jù)庫中顯示其突變頻率為0.000 033 14，其中，東亞人中的突變頻率為0.000 463 8；GnomAD數(shù)據(jù)庫中的突變頻率為0.000 042 77，其中，東亞人中的突變頻率為0.000 614 3；ClinVar數(shù)據(jù)庫對該位點尚無記錄。根據(jù)ACMG的指南，該位點的致病性等級為可能致病，但是因為該位點為雜合突變，AHI1基因上的單一雜合位點不足以解釋患兒的致病原因。因此我們接下來采用Sanger測序法對該位點在患兒和父母的DNA中進(jìn)行了驗證，并對AHI1基因的所有外顯子進(jìn)行了擴(kuò)增測序。

三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Sanger測序驗證

Sanger測序結(jié)果表明，先證者AHI1基因上的移碼突變位點c.533_534delAA來自母親(圖2)。并且，在對AHI1所有外顯子進(jìn)行擴(kuò)增測序以后，沒有在其他外顯子及剪接位點區(qū)域發(fā)現(xiàn)可能的致病突變，因此考慮利用全外顯子組測序數(shù)據(jù)對已知致病基因的拷貝數(shù)變異情況進(jìn)行分析。

紅色箭頭示變異位點所在的堿基圖2 AHI1基因c.533_534delAA位點的Sanger測序峰圖

四、拷貝數(shù)變異的分析

利用GATK的depth of coverage功能對患兒的全外測序數(shù)據(jù)中38個Joubert綜合征相關(guān)基因的平均測序深度進(jìn)行了統(tǒng)計分析(圖3)。其中測序深度最高的為CELSR2，平均測序深度為262.38×，AHI1基因的平均測序深度為98.49×，而NPHP1基因的測序深度為0.24×。通過IGV軟件查看bam文件中NPHP1基因的測序情況，發(fā)現(xiàn)該基因區(qū)段捕獲很少測序數(shù)據(jù)，由此，我們推測患兒的NPHP1可能存在純合型缺失。

五、NPHP1拷貝數(shù)變異的驗證

采用MLPA技術(shù)對患兒及其父母的NPHP1基因進(jìn)行拷貝數(shù)變異的驗證分析，同時取一個正常人的DNA進(jìn)行實驗，作為陰性對照。該試劑盒的探針覆蓋了NPHP1的所有外顯子區(qū)域。結(jié)果顯示，正常人的NPHP1基因的第1～20個外顯子NPHP1為2個拷貝，不存在拷貝數(shù)變化?；純旱腘PHP1基因的第1～20個外顯子全部為0拷貝，屬于NPHP1基因的純合型缺失，而患兒父親和母親的NPHP1基因的第1～20個外顯子為1個拷貝，屬于NPHP1基因的雜合型缺失(圖4)。

38個Joubert綜合征相關(guān)基因的平均測序深度。橫坐標(biāo)為全外顯子組測序包含的38個Joubert綜合征相關(guān)基因，縱坐標(biāo)為相應(yīng)基因的平均測序深度(×)圖3 Joubert綜合征相關(guān)基因的平均測序深度結(jié)果圖

A、B(先證者父親)，C、D(先證者母親)：均為NPHP1基因1～20號外顯子雜合型缺失；E、F：先證者，NPHP1基因1～20號外顯子的純合型缺失；G、H：陰性對照，NPHP1基因1～20號外顯子不存在拷貝數(shù)變化圖4 MLPA分析結(jié)果

討 論

Joubert綜合征是一種以小腦發(fā)育畸形為主要特征的罕見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。小腦蚓部發(fā)育不全、肌張力低、發(fā)育遲緩、異常呼吸或者異常眼運(yùn)動是1992年Saraiva和Baraitser制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。1997年Maria等[11]又把磁共振成像中的“磨牙征”等加入到Joubert綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)中。本研究中的患兒生后出現(xiàn)窒息，自幼發(fā)育落后，雙眼追視不良，四肢肌張力低，磁共振MRI顯示小腦蚓部小，且中腦呈“磨牙征”，符合Joubert綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

Joubert綜合征通常遵循常染色體隱性遺傳的模式，僅在因OFD1基因突變導(dǎo)致的患兒中表現(xiàn)出X連鎖隱性遺傳的特點。目前已有超過34個基因被確認(rèn)為Joubert綜合征的致病基因，可以解釋62%～94%受檢者的發(fā)病原因[6，12]。這些致病基因均與纖毛的功能相關(guān)，參與纖毛功能相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]，因此，Joubert綜合征又與腎單位腎癆(Nephronophthisis，NPHP)、先天性黑矇(Leber Congenital Amaurosis，LCA)、巴德-畢德氏綜合征(Bardet-Biedl Syndrome，BBS)等其他因纖毛基因突變導(dǎo)致的人類疾病統(tǒng)稱為“纖毛相關(guān)疾病(ciliopathy)”。

我們在利用全外顯子組測序查找患兒的分子遺傳學(xué)病因的過程中，首先發(fā)現(xiàn)了位于AHI1基因上的一個雜合移碼突變(c.533_534delAA，p.Glu178GlyfsTer3)。但是通過對AHI1所有外顯子區(qū)域的測序分析，沒有找到其他可能的致病位點，從而開始針對Joubert綜合征的已知致病基因進(jìn)行拷貝數(shù)變異的分析。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)了NPHP1基因所在區(qū)域的測序深度均接近于0，提示該基因可能存在純合缺失。隨后，我們利用MLPA方法對患兒及其父母的NPHP1拷貝數(shù)進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明患兒確實存在NPHP1全基因的純合型缺失，父母均為NPHP1基因的雜合型缺失，符合遺傳共分離定律，最終明確了該患兒為NPHP1純合型缺失所導(dǎo)致的Joubert綜合征4型。

NPHP1編碼基因定位于2q13，具有20個外顯子。Hildebrandt等[14]于1997年首次發(fā)現(xiàn)NPHP1與青少年型腎單位腎癆(Juvenile Nephrophthisis)有關(guān)。除此之外，NPHP1基因突變可以導(dǎo)致Joubert綜合征4型和家族性腎視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良1型[15](Senior-Loken Syndrome，SLS)。這三種疾病的臨床表現(xiàn)彼此交疊。在NPHP1的突變譜中，長達(dá)290 kb的純合缺失是其主要的突變形式，也有部分患者攜帶點突變并伴有基因的雜合型缺失[16-17]。2011年，Chaki等[18]對來自365個家系中的440個具有腎單位腎癆相關(guān)表現(xiàn)的纖毛疾病患者進(jìn)行了基因型和表型的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)有來自235個家系的248名患者是由于NPHP1基因突變導(dǎo)致的，其中有93%(219/235)的NPHP1突變都是基因的純合缺失。這235個NPHP1突變的家系均表現(xiàn)出典型的青少年腎單位腎癆，終末期腎衰竭發(fā)病年齡大于4歲。其中，76.5%的家系(180/235)僅僅有腎臟受累的情況，而剩下的55個家系同時伴有其他器官的受累，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、肝臟和心臟。2013年，Halbritter等[19]對全世界范圍內(nèi)具有腎單位腎癆相關(guān)表型的1 540名患者進(jìn)行遺傳學(xué)研究，結(jié)果提示在551名具有明確分子診斷的患者中超過一半以上是因為NPHP1突變導(dǎo)致。盡管NPHP1是腎單位腎癆的最主要致病基因，但是在Joubert綜合征的患者中，NPHP1突變所占的比例非常小。2015年，Bachmann-Gagescu等[6]對375個Joubert綜合征家系進(jìn)行了遺傳學(xué)分析，最終為279名患者找到了可能的致病病因，但其中僅有5名患者為NPHP1突變，占比1.8%。值得一提的是這5名NPHP1突變的Joubert綜合征患者都是因為NPHP1基因的純合型缺失導(dǎo)致的。

目前國內(nèi)文獻(xiàn)報道具有明確基因診斷的Joubert綜合征病例并不多見，主要致病基因分別為CC2D2A[20-22]、CEP290[23-24]、OFD1[25]、TMEM67、C5orf42[26]、CSPP1[27]以及INPP5E[28-29]等，尚未有NPHP1基因突變所致Joubert綜合征的報道。對于腎單位腎癆而言，國內(nèi)的研究也主要以零星的臨床病例報道為主，1982～2016年間共報道腎單位腎癆病例數(shù)120余例[30]，其中由于NPHP1大片段純合缺失所導(dǎo)致的少年型腎單位腎癆的病例僅有10例[17，31-33]，2例為男孩，發(fā)病年齡分別為9歲和12歲，均在一年內(nèi)快速進(jìn)展為終末期腎衰竭，另有3例存在NPHP1大片段純合缺失的患兒進(jìn)入慢性腎臟病(chronic kidney diseases，CKD)V期的中位數(shù)年齡為8.5歲。由于NPHP1純合缺失與腎臟并發(fā)癥密切相關(guān)，因此在為患兒明確基因診斷以后，醫(yī)生對患兒進(jìn)行了尿常規(guī)、腎功能、尿微量蛋白及B超等檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。考慮到本例患兒至今不足5歲，已囑咐家長密切觀察，如有多飲多尿現(xiàn)象及早就診，定期隨訪，爭取做到并發(fā)癥的早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)。

NPHP1基因突變導(dǎo)致疾病的具體分子機(jī)理尚不明確，其編碼的蛋白產(chǎn)物是Nephrocystin-1(也稱為Nephrocystin)。該蛋白特異定位于腎單纖毛和呼吸道上皮細(xì)胞纖毛的纖毛基部(Cilia Base)至轉(zhuǎn)換區(qū)(Transition Zone，TZ)，以及光感受器連接纖毛內(nèi)段和外段的交界處，也定位于其他組織的細(xì)胞連接區(qū)、纖毛和細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)合位點[16，34]，可調(diào)控 Par3/Par6/aPKC復(fù)合體的Par6 磷酸化狀態(tài)促進(jìn)緊密連接形成[32]，并參與細(xì)胞黏附、局灶性粘連復(fù)合體的形成以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。

綜上所述，本文采用全外顯子組測序技術(shù)，結(jié)合MLPA方法，證實了NPHP1基因的純合缺失是導(dǎo)致該Joubert綜合征患兒的致病原因。此病例的研究主要有三方面的意義：(1)盡管國內(nèi)之前分別報道過CEP290、TMEM67、C5orf42、CSPP1、INPP5E以及OFD1等基因突變導(dǎo)致的Joubert綜合征病例，但是NPHP1基因突變所致的Joubert綜合征尚屬國內(nèi)首例。(2)以往針對Joubert綜合征的臨床遺傳學(xué)研究多采用靶向基因組測序或者全外顯子組測序方法，數(shù)據(jù)分析和解讀過程中主要關(guān)注點突變，幾乎不考慮拷貝數(shù)的變化。本病例雖然也采用了全外顯子組測序，但是當(dāng)AHI1基因單一雜合移碼突變不足以解釋致病原因時，考慮到了拷貝數(shù)變異的可能性，增加了對目標(biāo)基因平均測序深度的分析，得到了NPHP1基因可能存在純合缺失這個重要的提示，并采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)進(jìn)行驗證，最終證實了該病例是因為NPHP1整個基因的大片段純合缺失導(dǎo)致的，這提示我們在單基因病的數(shù)據(jù)分析過程中，要考慮多種可能的突變形式，不能僅僅局限于點突變的分析。(3)雖然此次報道的患兒目前并未表現(xiàn)出腎臟功能的損害，但由于其致病基因是NPHP1，該基因已被研究證明與腎臟損害直接相關(guān)，患兒被確診為Joubert綜合征4型，具有很高的腎病發(fā)病風(fēng)險。臨床和遺傳學(xué)相結(jié)合所作出的癥狀前診斷不僅有助于了解患兒的預(yù)后，同時對于指導(dǎo)患兒的隨訪具有重要的意義。