李煦，徐美，吳玉文，周自成，范小振

（滄州師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，河北 滄州 061001）

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）又名黃須菜、海英菜，是一種抗鹽能力出眾、生命頑強(qiáng)的鹽堿地指示植物，能有效減少鹽堿地區(qū)土壤表層含鹽量[1]，提高土壤動(dòng)植物有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤環(huán)境，是近年來(lái)改良、開(kāi)發(fā)鹽堿土壤的首選植物，能夠取得較好的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)效益[2]。鹽地堿蓬富含營(yíng)養(yǎng)，其種籽油含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸；莖葉中含有大量維生素和多種微量元素。近年來(lái)，對(duì)鹽地堿蓬的研究，主要集中在其種籽油的提取[3]、總黃酮的提取測(cè)定[4]及其中無(wú)機(jī)元素的確定[5]。多糖是由多個(gè)單糖通過(guò)脫水形成的糖苷鏈，具有降血糖[6]、抗腫瘤[7]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[8]、抗氧化[9]、抗衰老等功效。目前對(duì)鹽地堿蓬中多糖提取工藝的研究相對(duì)較少，且效率較低。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)出一條時(shí)間短、效率高、工藝簡(jiǎn)單的堿蓬多糖提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鹽地堿蓬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，保持和重建鹽堿地生態(tài)，提高鹽堿土壤農(nóng)產(chǎn)品附加值提供智力支持。

提取植物多糖的方法有水提法、堿提法、酶提法、微波輔助法、超聲波輔助法、超聲-微波協(xié)同法等。劉玉芬等[10]采用水提法提取堿蓬多糖，最佳提取條件為：提取溫度 87 ℃、提取時(shí)間 3.5 h、液料比 31.5 ∶1（mL/g），在此條件下堿蓬粗多糖得率為2.028%。該方法雖成本低廉、操作簡(jiǎn)單，但得率較低。龐庭才等[11]采用堿提法提取堿蓬多糖，最佳提取條件為：NaOH 溶液濃度0.17 mol/L，料液比 1 ∶42.5（g/mL）、提取溫度 83.5 ℃、提取時(shí)間3.4 h，此條件下多糖提取率較水提法大大增加，為8.00%。馬波等[12]對(duì)酶法輔助超聲波提取鹽地堿蓬多糖進(jìn)行了研究，在堿性果膠酶加入量為0.4 %，pH 10，料液比 1 ∶25（g/mL），超聲溫度 45 ℃，時(shí)間20 min，超聲功率120 W 的條件下，堿蓬多糖提取率可達(dá)8.56%。使用超聲波輔助提取可縮短提取時(shí)間，降低提取溫度[13-14]。但超聲波輔助提取熱效應(yīng)不強(qiáng)，在提取過(guò)程中難以達(dá)到足夠高的提取溫度[15]，超聲-微波協(xié)同法將微波與超聲波的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合，使植物細(xì)胞內(nèi)部多糖從細(xì)胞中釋放出來(lái)的效率更高，速度更快[16-17]。

目前，超聲-微波協(xié)同輔助提取鹽地堿蓬多糖的報(bào)道尚未見(jiàn)到。文中采用超聲-微波協(xié)同法輔助提取鹽地堿蓬莖葉多糖，并通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿蓬多糖的提取工藝，以期為鹽地堿蓬資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽地堿蓬莖葉粉末：采集于河北省滄州市沿海地區(qū)，40 ℃干燥至恒重后，用粉碎機(jī)粉碎20 s，過(guò)60 目篩，密封備用。

硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、雙氧水（30%）、葡萄糖、苯酚：均為分析純?cè)噭?，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（VC）、叔丁基對(duì)苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、 三 羥 基 氨 基 甲 烷（trihydroxy aminomethane，Tris）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-SM200 型超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；UV-2550 型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；TDL-5 型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)：江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠；FA2004N 型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SL-100 型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金廠；101A-1E 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；HHS-11-1 型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鹽地堿蓬莖葉中多糖的提取與測(cè)定

按照一定料液比，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的鹽地堿蓬莖葉粉末，添加80 mL 蒸餾水，混合均勻后，設(shè)定超聲-微波協(xié)同提取條件進(jìn)行多糖的提取，離心，上清液為多糖溶液。

鹽地堿蓬莖葉中多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[18-19]，得率的計(jì)算按照如下公式：

式中：K 為鹽地堿蓬莖葉多糖得率，%；n 為稀釋倍數(shù)；C 為測(cè)得多糖溶液質(zhì)量濃度，g/mL；V 為提取液體積，mL；M 為鹽地堿蓬樣品質(zhì)量，g。

以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為X 軸，以吸光度為Y軸，繪制出繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得多糖回歸方程為：Y=7.235 7X-0.008 3，R2=0.996 6。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

依據(jù)上述提取方法，以蒸餾水為提取劑，選擇超聲功率、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4 個(gè)因素作為變量對(duì)鹽地堿蓬莖葉中多糖提取工藝進(jìn)行研究。在試驗(yàn)過(guò)程中，固定微波功率200 W，各因素的考查范圍分別為：超聲功率 120、240、360、480、600 W；料液比 0.3 ∶80、0.5 ∶80、0.7 ∶80、1.0 ∶80、2.0 ∶80、3.0 ∶80（g/mL）；提取溫度 40、50、60、70、80 ℃；提取時(shí)間 5、10、15、20、25 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在微波功率200 W 條件下，根據(jù)響應(yīng)面分析法中Box-benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以料液比、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度4 個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)四因素三水平共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in the response suiface design

1.3.4 抗氧化性分析

1.3.4.1 清除羥基自由基活性測(cè)定

將6.3 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和6.7 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各2.00 mL 均勻混合，添加不同質(zhì)量濃度（0.38、0.95、1.90、2.85、3.80、5.10 mg/mL）的鹽地堿蓬多糖溶液2.00 mL，啟動(dòng)反應(yīng)時(shí)添加8.8 mmol/L 雙氧水，靜置10 min，取上層清液于510 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率。配置同等濃度梯度的VC溶液，在相同條件下測(cè)定吸光度，進(jìn)行對(duì)照[20]。

清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ai為樣品吸光度；Ai0為以蒸餾水代替雙氧水的吸光度；A0為以蒸餾水代替樣品的空白吸光度。

1.3.4.2 清除超氧陰離子自由基活性測(cè)定

取 4.5 mLTris-HCl 緩沖溶液（pH 8.2），25 ℃預(yù)熱10 min，加入0.1 mL 不同質(zhì)量濃度的堿蓬多糖溶液，均勻混合后于25 ℃水浴靜置10 min，加入鄰苯三酚于25 ℃水浴反應(yīng)10 min，加入HCl 終止反應(yīng)，測(cè)定325 nm處吸光值。用蒸餾水代替堿蓬多糖溶液，采用同樣方法進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率[21]。清除率計(jì)算公式如下：

1.3.4.3 清除DPPH活性測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度的堿蓬多糖溶液各1.0 mL，加入DPPH 溶液，避光反應(yīng)30 min 后，于517 nm 處測(cè)定吸光值，計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的清除率[22]。清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ai為DPPH·與樣品混合溶液的吸光值；Ai0為樣品與無(wú)水乙醇混合液的吸光值；A0為DPPH·與蒸餾水混合溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響

以蒸餾水為提取劑，在微波功率200 W，提取溫度70 ℃、超聲功率360 W、提取時(shí)間15 min 的條件下，考察不同料液比對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of soild-liquid ratio on the extraction rate

由圖1可見(jiàn)，隨料液比增大，多糖得率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。在0.5 ∶80（g/mL）時(shí)得率最高，為9.7%。料液比增加，多糖的溶出量隨之增加，得率升高；當(dāng)料液比繼續(xù)增大，多糖溶出可能達(dá)到飽和，但加入的物料質(zhì)量在增加，導(dǎo)致得率降低[23]。所以料液比選擇0.5 ∶80（g/mL）。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響

2.3 引產(chǎn)期間胎盤(pán)娩出情況 本組48例引產(chǎn)者中有44例胎兒及胎盤(pán)附屬物完全自行娩出，另有2例胎盤(pán)及其附屬物娩出不徹底，行B超引導(dǎo)下清宮術(shù)輔助終止妊娠，2例藥流聯(lián)合水囊引產(chǎn)失敗后行鉗刮術(shù)，完全流產(chǎn)率為91.7 % (44/48)。引產(chǎn)成功病例中產(chǎn)后清宮率4.3%(2/46)。

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、提取溫度70 ℃、超聲功率360 W 的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate

由圖2可見(jiàn)，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)得率呈先升高后下降趨勢(shì)，在20 min 時(shí)達(dá)到最高，為9.8%?？赡茉谔崛r(shí)間較短時(shí)，多糖釋放不充分；提取時(shí)間延長(zhǎng)后，細(xì)胞破碎程度加大，溶出量提高，得率也提高；當(dāng)超過(guò)20 min后，得率降低，可能是鹽地堿蓬多糖在較長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用下結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生了變化，如降解為單糖[24-25]，導(dǎo)致多糖得率的降低。因此提取時(shí)間選擇20 min。

2.1.3 提取溫度對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、超聲功率360 W、提取時(shí)間20 min 的條件下，考察不同提取溫度對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate

由圖3可見(jiàn)，隨著提取溫度的升高，得率呈先上升后下降的趨勢(shì)；在70 ℃時(shí)得率達(dá)到最高。升高溫度有助于溶劑的滲透和多糖的擴(kuò)散；超過(guò)70 ℃后，水分蒸發(fā)量增加明顯，可能對(duì)多糖的溶出造成不良影響，溫度過(guò)高也可能使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致已溶出多糖的降解，從而使堿蓬多糖得率降低[26-27]。所以提取溫度選擇70 ℃。

2.1.4 超聲功率對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間20 min 條件下，考察不同超聲功率對(duì)鹽地堿蓬多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲功率對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate

由圖4可見(jiàn)，隨超聲功率增大得率呈先升高后下降趨勢(shì)；在360 W 時(shí)達(dá)到最高，為9.8%。原因可能是超聲功率較小時(shí)作用力不強(qiáng)，細(xì)胞破碎程度不足，多糖溶出較少；較高功率的超聲波會(huì)降低空化作用，使氣泡塌縮程度不足[28]，導(dǎo)致多糖得率下降。因此，超聲功率選擇360 W。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

在微波功率200 W 條件下，根據(jù)響應(yīng)面分析法中Box-benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、超聲功率（D）為自變量，設(shè)計(jì)四因素三水平共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 RSM design and results

2.2.2 回歸模型方差擬合及結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到結(jié)果如表3所示。經(jīng)二次多元回歸擬合，得到回歸方程如下：

提取率/%=-62.238 75+1.221 00A+38.041 67B+1.058 17C+0.074 632D+0.050 000AB-4.500 00×10-3AC-4.166 67×10-5AD+0.050 000BC+1.041 67×10-3BD+3.261 28×10-18CD-0.052 290 0A2-42.125 00B2-7.100 00×10-3C2-1.039 93×10-4D2

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

模型的 F 值為 105.63，P＜0.000 1，差異極顯著。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚哦冗M(jìn)行分析，得到R2=0.990 6，R2adj=0.981 2，接近于1，表明響應(yīng)值的變化有99.06%來(lái)自于所選因素，該方程擬合度較好。失擬項(xiàng)P 值為0.4585，差異不顯著，說(shuō)明該響應(yīng)面模型所設(shè)計(jì)并進(jìn)行的非正常試驗(yàn)誤差較小，二次模型具有合理性[29]，可以用此模型來(lái)確定提取鹽地堿蓬多糖的最佳工藝條件。通過(guò)因素顯著性來(lái)分析模型系數(shù)，可以看出因素AC 即提取時(shí)間和提取溫度的交互作用極顯著，其他單因素之間交互作用顯著性不明顯。F 值的大小反應(yīng)了各因素對(duì)于多糖得率的影響強(qiáng)弱，各單因素對(duì)多糖得率的影響順序是：料液比＞提取時(shí)間＞超聲功率＞提取溫度。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

各因素對(duì)鹽地堿蓬莖葉多糖得率的影響及各因素之間的交互作用如圖5所示。

由響應(yīng)面曲線形狀可以判斷出各因素對(duì)鹽地堿蓬莖葉中多糖得率的影響程度。響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對(duì)多糖得率影響越顯著[30]。圖5a 為提取時(shí)間、料液比的交互作用，料液比的響應(yīng)曲面更加陡峭，因此料液比對(duì)多糖得率的影響較提取時(shí)間更為顯著；圖5b 為料液比、超聲功率的交互作用，料液比的響應(yīng)曲面更加陡峭，因此料液比對(duì)多糖得率的影響較超聲功率更為顯著；圖5c 為提取時(shí)間、提取溫度的交互作用，提取時(shí)間的響應(yīng)曲面更加陡峭，因此提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響較提取溫度更為顯著；圖5d 為料液比、提取溫度的交互作用，料液比的響應(yīng)曲面更加陡峭，因此料液比對(duì)多糖得率的影響較提取溫度更為顯著；圖5e 為提取溫度、超聲功率的交互作用，超聲功率的響應(yīng)曲面更加陡峭，因此超聲功率對(duì)多糖得率的影響較提取溫度更為顯著；圖5f 為提取時(shí)間、超聲功率的交互作用，提取時(shí)間的響應(yīng)曲面更加陡峭，因此提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響較超聲功率更為顯著。該結(jié)論與表3方差分析相符合。響應(yīng)曲面等高線圖中，等高線的形狀為橢圓形表示因素存在顯著交互作用，圓形表示不顯著[31]。圖5中各組等高線均為橢圓形，說(shuō)明各因素對(duì)多糖得率存在交互作用。

圖5 兩因素交互作用對(duì)得率的影響Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the oil extraction rate

2.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)最佳工藝條件及驗(yàn)證性試驗(yàn)

對(duì)回歸方程求解，得到響應(yīng)面擬合的鹽地堿蓬莖葉中多糖提取工藝的最佳條件為：料液比0.51 ∶80（g/mL）、超聲功率365.61 W、提取時(shí)間20.69 min、提取溫度69.75℃。預(yù)測(cè)優(yōu)化后的得率為10.6374%。結(jié)合儀器的現(xiàn)實(shí)要求，將最佳工藝參數(shù)修正為：料液比 0.51 ∶80（g/mL）、超聲功率366 W、提取時(shí)間21 min、提取溫度70 ℃。取3 等份鹽地堿蓬莖葉原料進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果分別為：10.739%、10.681%、10.722%，驗(yàn)證試驗(yàn)所得平均得率10.714%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.720。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)相應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相吻合，證明響應(yīng)面法可以有效的優(yōu)化鹽地堿蓬莖葉多糖提取工藝。

2.3 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 堿蓬多糖清除羥基自由基的活性測(cè)定

圖6為不同質(zhì)量濃度的堿蓬多糖和VC清除羥基自由基的活性對(duì)比。VC對(duì)羥基自由基的清除率接近100%，堿蓬多糖在濃度較低時(shí)清除羥基自由基的活性很差，隨濃度增大其對(duì)羥基自由基清除率迅速升高，在濃度達(dá)到2.85 mg/mL 后，羥基自由基清除率隨堿蓬多糖質(zhì)量濃度增加變化不再明顯。堿蓬多糖濃度達(dá)5.1 mg/mL 時(shí)羥基自由基清除率最高，達(dá)到89.2%。

圖6 羥基自由基清除試驗(yàn)Fig.6 Experimental results on the elimination of hydroxyl radicals

2.3.2 堿蓬多糖清除DPPH·的活性測(cè)定

不同質(zhì)量濃度的堿蓬多糖對(duì)DPPH·的清除活性如圖7所示，選擇VC進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。隨濃度增大堿蓬多糖對(duì)DPPH·的清除率逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到5.1 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH·清除率最高，達(dá)到81.9%。

圖7 DPPH·清除試驗(yàn)Fig.7 Experimental results on the elimination of DPPH·

2.3.3 堿蓬多糖清除O2-·的活性測(cè)定

不同質(zhì)量濃度的堿蓬多糖和VC對(duì)O2-·的清除活性如圖8所示，兩者對(duì)O2-·的清除活性均隨質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到5.1 mg/mL 時(shí)兩者對(duì)O2-·的清除活性均為最高，堿蓬多糖達(dá)到79.2%。雖然活性較VC低，但能夠說(shuō)明鹽地堿蓬多糖在濃度較高時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果良好。

圖8 超氧陰離子清除試驗(yàn)Fig.8 Experimental results on the elimination of O2-·

3 結(jié)論

以鹽地堿蓬莖葉粉末（60 目）為原料，選擇超聲-微波協(xié)同法提取鹽地堿蓬莖葉中多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出結(jié)論如下：

響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳提取工藝為：料液比0.51 ∶80（g/mL）、超聲功率 366 W、提取時(shí)間 21 min、提取溫度70 ℃。在此優(yōu)化條件下多糖得率為（10.714±0.720）%，接近響應(yīng)面優(yōu)化法得到的理論值。

抗氧化性能試驗(yàn)表明，鹽地堿蓬莖葉多糖對(duì)于羥基自由基、DPPH·和O2-·均有較強(qiáng)的清除能力，其抗氧化活性隨多糖濃度增加而增大，濃度達(dá)到5.1 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基、DPPH·和O2-·的清除率分別為89.2%、81.9%、79.2%，接近VC。說(shuō)明鹽地堿蓬莖葉多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性能，可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，具有一定的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。