孟金明，樊愛(ài)萍，吳依婕，曾麗萍

（紅河學(xué)院理學(xué)院，云南 蒙自 661199）

枇杷作為云南蒙自的特色水果之一，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是枇杷果實(shí)沒(méi)有后熟作用，需在樹(shù)上成熟后采收，且采摘后的枇杷易失水皺縮及受到機(jī)械傷害和病菌的侵染，很難進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的貯藏和長(zhǎng)距離運(yùn)輸，這制約了枇杷種植業(yè)的發(fā)展[1-2]。目前，常采用低溫冷藏的技術(shù)延長(zhǎng)枇杷的貨架期，低溫確實(shí)可以降低采后果實(shí)的呼吸，延長(zhǎng)其貯藏時(shí)間，但由于枇杷果實(shí)具有低溫敏感性，經(jīng)冷藏后枇杷果肉木質(zhì)化嚴(yán)重，質(zhì)地生硬，口感嚴(yán)重下降，降低其食用價(jià)值[3-4]。因此，找到一種有效處理采后枇杷的方式，減緩貯藏過(guò)程中冷害的發(fā)生，是枇杷保鮮急需解決的問(wèn)題之一。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；难苌铮瑹o(wú)毒無(wú)害、可食用、可生物降解并具有良好的成膜性，是制作可食性包裝材料的理想原料[5]。乳清蛋白是奶酪工業(yè)的副產(chǎn)物，具有良好的乳化性、凝膠性及成膜性，是制造可食性膜常用的材料[6]。將殼聚糖與乳清蛋白兩種成膜材料進(jìn)行復(fù)合可以彌補(bǔ)單一材料成膜后的一些物理性能上的缺陷，但是制成的復(fù)合膜在抑菌和抗氧化性能方面還存在缺陷。木姜子精油是從木姜子中提取得到的一種植物精油，具有抑菌效果、抗氧化性和對(duì)生物的趨避性等天然特性，在食品保鮮領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值[7]。本試驗(yàn)將制成的可食性膜液用于采后枇杷的涂膜保鮮，研究其對(duì)冷藏枇杷木質(zhì)化及相關(guān)酶活性的影響，為采后枇杷的貯藏保鮮提供理論依據(jù)及實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為蒙自的大五星枇杷果實(shí)，選擇無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷，大小均勻、成熟度一致的枇杷果實(shí)作為試驗(yàn)的材料。殼聚糖（脫乙酰度95%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；乳清蛋白：美國(guó)Hilma 公司W(wǎng)PI9410；硫代巴比妥酸、鹽酸羥胺、溴化乙酰、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、氫氧化鈉、磷酸均為分析純（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

T6 新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XHF-D 型高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TGL20M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津齊欣科學(xué)儀器有限公司；CP224C 型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合膜液的制備

參照陳悅等[8]方法，略作修改。取一定量的殼聚糖溶于2%乙酸的溶液中，配制成濃度為1%的殼聚糖乙酸溶液，再稱取一定量的乳清蛋白溶于去離子水中，配制成濃度為1%的乳清蛋白溶液，然后將兩者按3 ∶1（體積比）的比例混合，然后添加一定量的木姜子精油，制得木姜子精油添加量為總固形物質(zhì)量的0%、3%、6%、9%、12%的復(fù)合膜液。

1.2.2 枇杷涂膜保鮮處理

先把選取好的枇杷分成大小均勻的5 份，將枇杷分別置于不同木姜子精油濃度的膜液中浸泡1 min，取出后自然晾干，于8 ℃恒溫恒濕箱下貯藏，每隔5 d 取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次。

1.2.3 保鮮指標(biāo)的測(cè)定

1.2.3.1 失重率

采用稱量法測(cè)定[9]。

1.2.3.2 果實(shí)出汁率的測(cè)定

參照張瑜等[10]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.3 丙二醛（malondialdehyde，MDA）的測(cè)定

參照Pasquariello 等[11]方法進(jìn)行測(cè)定，稱取枇杷2.5 g，加 0.2 g 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），7.5mLpH=8.8 硼酸緩沖液，冰浴下研磨，4 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL 酶液，加1.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸 （4，6-Dihydroxy-2-mercaptopyrimidine，TBA）溶液（用20%的三氯乙酸配成），沸水浴20 min，迅速冷卻然后12 000 r/min 離心10 min，取上液分別于450、532 nm 和 600 nm 處測(cè)定其 OD 值，計(jì)算如公式所示：

MDA 含量 （μmol·g-2）=[6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450]×V×（A/a）/W

式中：V 為提取液總量，mL；A 為反應(yīng)液總量，mL；a 為測(cè)定提取液量，mL；W 為材料重，g。

1.2.3.4 木質(zhì)素含量的測(cè)定

參照Morrison[12]的方法，稱取4 g 果肉，加入5 mL 95%乙醇溶液冰浴研磨，在4 500 r/min 離心20 min，用95%的乙醇沖洗沉淀 3 次，再用乙醇-正己烷（1 ∶2，體積比）沖洗3 次，收集沉淀并干燥，將干燥物溶于25%溴化乙酰冰醋酸溶液，70 ℃恒溫水浴30 min，加入1 mL 2 mol/L 的NaOH 溶液終止反應(yīng)，再加5 mL 冰醋酸和0.1 mL 鹽酸羥胺，用冰醋酸定容至10 mL。在280 nm處測(cè)定樣品提取液吸光值，結(jié)果以O(shè)D280nm/gFW 表示，測(cè)定3 次重復(fù)。

1.2.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的測(cè)定

參照詹嘉紅等[13]方法測(cè)定PPO 活性，稱取5 g 果肉加入5 mL 含2 g PVP 的磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.5），冰浴研磨，然后 4 ℃ 12 000 r/min 離心 20 min，取0.1 mL 上清液加入1.9 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液，1 mL 0.1 mol/L 的鄰苯二酚溶液，在420 nm 下測(cè)定混合液3 min 內(nèi)吸光度值的變化（每30 s 記錄一次）。酶活性以每分鐘吸光度值變化0.01 個(gè)單位為一個(gè)酶活單位，結(jié)果以U/gFW 表示，測(cè)定3 次重復(fù)。

1.2.3.6 過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的測(cè)定

參照曹建康等[14]方法進(jìn)行測(cè)定，酶液提取同PPO，取0.1 mL 酶液加入2.7 mL pH 6.5 0.2 mol/L 的磷酸緩沖液、0.1 mL 4 %的愈創(chuàng)木酚、0.1 mL 0.5 % H2O2。于470 nm 處測(cè)定10 min 內(nèi)吸光度的變化值。酶活性以每分鐘吸光度值變化0.01 個(gè)單位為一個(gè)酶活單位，結(jié)果以U/gFW 表示，測(cè)定3 次重復(fù)。

1.2.3.7 苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的測(cè)定

參照Z(yǔ)HAO 等[15]方法進(jìn)行測(cè)定，稱取2.5 g 果肉，加入 7.5 mL 含 0.2 g PVP 的硼酸緩沖液（pH 8.8），冰浴研磨，4 000 r/min 離心15 min，取0.2 mL 上清液加入3 mL 硼酸緩沖液（pH 8.8），0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸，37 ℃水浴加熱1 h，于290 nm 處測(cè)定吸光值，酶活性以每分鐘吸光度值變化0.001 個(gè)單位為一個(gè)酶活單位，結(jié)果以U/gFW 表示，測(cè)定3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步處理及作圖，用SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，認(rèn)為P＜0.05 時(shí)差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±n，n=3）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)出汁率的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，枇杷表面及內(nèi)部的水分不斷散失，造成枇杷果皮皺縮不易剝離，可溶性果膠含量不斷下降，果肉變硬和品質(zhì)下降。復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)失重率和出汁率的影響見(jiàn)圖1。

從圖1a 可以看得出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，枇杷果實(shí)的失重率不斷升高，在整個(gè)貯藏期對(duì)照組的失水比較嚴(yán)重，果皮褶皺最為嚴(yán)重，而處理組的枇杷失重率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），從感官上看果實(shí)的褶皺情況也明顯好于對(duì)照組；從圖1b 可以看得出，枇杷果實(shí)的出汁率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷降低，3%和6%處理組的枇杷出汁率明顯要優(yōu)于對(duì)照組和其他處理組。這可能是由于膜溶液在枇杷果實(shí)表面形成一層薄膜，產(chǎn)生一種微氣調(diào)環(huán)境，抑制了其呼吸作用，從而減少了枇杷重量的損失[16]。隨著木姜子精油添加量的繼續(xù)增加，枇杷果實(shí)的出汁率下降，推測(cè)可能與藥害[17]反應(yīng)有關(guān)。

圖1 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)失重率和出汁率的影響Fig.1 Effect of composite membrane treatments on weight loss and juice percentage of loquat fruits during cold storage

2.2 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)MDA含量的影響

MDA 就是膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物。它可以與蛋白質(zhì)氨基酸殘基或核酸反應(yīng)生成西弗堿，破壞細(xì)胞完整性，降低膜的穩(wěn)定性，促使果實(shí)衰老和腐爛。其含量是衡量果實(shí)細(xì)胞膜通透性的重要指標(biāo)，間接反映了膜損傷的程度[18]。復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)MDA 含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)MDA 含量的影響Fig.2 Effect of composite membrane treatments on MDA of loquat fruits during cold storage

從圖2可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，枇杷果實(shí)中MDA 的含量持續(xù)增加。在貯藏前期MDA 含量增加較緩慢，到儲(chǔ)藏后期15 d 以后，6%濃度的處理組果實(shí)MDA 含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其他處理組的MDA 的含量也低于對(duì)照組。說(shuō)明了涂膜處理能有效抑制膜脂過(guò)氧化作用，減少果實(shí)MDA 的含量。這可能是由于經(jīng)過(guò)木姜子涂膜處理，枇杷果肉中清除自由基的酶活力增強(qiáng)，枇杷的膜脂過(guò)氧化作用受到抑制，MDA合成量降低，從而保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，有效保持冷藏枇杷的品質(zhì)。

2.3 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量的影響

木質(zhì)素為植物次生代謝的產(chǎn)物，是植物細(xì)胞壁的二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分，其含量的高低直接反映了果實(shí)的衰老程度，進(jìn)而直接影響果實(shí)的質(zhì)量[19]。枇杷發(fā)生冷害的最重要特征就是果肉木質(zhì)素含量升高，果肉組織質(zhì)地老化。復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量的影響Fig.3 Effect of composite membrane treatments on lignin of loquat fruits during cold storage

從圖3中可以看出，在貯藏前期木質(zhì)素的含量增加緩慢，隨后增加迅速，在貯藏后期趨于平緩。枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量與木姜子精油濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，木姜子精油濃度越高，木質(zhì)素水平越低，但當(dāng)木姜子精油濃度達(dá)到一定水平后，增加木姜子精油濃度，枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量沒(méi)有明顯的降低。第10 天開(kāi)始，3%和6%處理組木質(zhì)素含量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）且與這兩個(gè)處理組之間不存在顯著性差異?？梢?jiàn)涂膜處理能夠有效降低果實(shí)木質(zhì)素含量，延緩了其老化進(jìn)程，減緩了枇杷冷害的發(fā)生。

2.4 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)PAL的影響

冷藏枇杷果肉組織中木質(zhì)素的合成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，是各種酶和非酶物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，目前對(duì)催化木質(zhì)素生物合成的酶類研究較多的是PPO、PAL、POD。木質(zhì)素是植物苯丙烷代謝途徑的主要終產(chǎn)物之一，PAL 是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，PAL 可以作為木質(zhì)化開(kāi)始的標(biāo)志酶[20]。低溫條件下可以引起細(xì)胞壁物質(zhì)代謝異常，PAL 活性上升，木質(zhì)素和纖維素含量增多，導(dǎo)致果肉木質(zhì)化敗壞。復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)PAL 的影響見(jiàn)圖4。

圖4 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)PAL 的影響Fig.4 Effect of composite membrane treatments on PAL activity of loquat fruits during cold storage

從圖4可以看出所有試驗(yàn)組枇杷PAL 活性呈先上升后降低的趨勢(shì)，在貯藏的第10 天到達(dá)最高值，但是6 %處理組PAL 活性峰值與對(duì)照組相比降低了24.65%，在貯藏的后期涂膜組的PAL 活性也低于對(duì)照組。說(shuō)明用木姜子/殼聚糖涂膜處理，能有效的抑制PAL 活性，因?yàn)镻AL 是枇杷木質(zhì)化過(guò)程中的關(guān)鍵酶和限速酶，所以能在一定的程度上減緩枇杷在冷藏的過(guò)程中的木質(zhì)化進(jìn)程。

2.5 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)POD的影響

POD 是促進(jìn)木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一，在木質(zhì)素生物合成的最后一中POD 催化H2O2的分解，聚合木質(zhì)素單體，促進(jìn)組織木質(zhì)素的合成，加速組織木質(zhì)化過(guò)程并加速其衰老敗壞[21]。復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)POD 含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)POD 含量的影響Fig.5 Effect of composite membrane treatments on POD activity of loquat fruits during cold storage

從圖5可以看得出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)枇杷果實(shí)POD 的活性呈現(xiàn)出先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，在貯藏的第10 天到達(dá)最高值，在貯藏的前15 天6%處理組POD 酶活性明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），在貯藏的后期3%和9%處理組POD 酶活性較低，兩處理組POD活性差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明用木姜子/殼聚糖涂膜處理，能有效的抑制POD 活性的增加，減少組織木質(zhì)素的合成，減緩其木質(zhì)化進(jìn)程。

2.6 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)PPO的影響

PPO 是酚類物質(zhì)合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。在PPO 的作用下，既可以將組織中的酚類氧化引起組織顏色變化，又可以催化香豆酸轉(zhuǎn)化成咖啡酸，參與木質(zhì)素的合成[22]。復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)PPO 的影響見(jiàn)圖6。

圖6 復(fù)合膜處理對(duì)冷藏枇杷果實(shí)PPO 的影響Fig.6 Effects of composite membrane treatments on PPO activity of loquat fruits during cold storage

從圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)PPO 活性呈上升的趨勢(shì)，在貯藏的前期，處理組PPO 活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），貯藏到10 d 后6%處理組PPO活性明顯低于對(duì)照組兩者存在顯著性差異（P＜0.05），其PPO 活性總體低于其他處理組。說(shuō)明用復(fù)合膜液涂膜處理，能有效的抑制PPO 活性的增加，一方面降低了枇杷果實(shí)褐變的程度，另一方面影響了組織木質(zhì)素的合成，緩解低溫對(duì)枇杷的影響，延長(zhǎng)了貨架期。

3 討論與結(jié)論

植物精油是從植物的花、種子、莖、葉、根等部位萃取出來(lái)的，且具有芳香性和揮發(fā)性的一類油狀液體物質(zhì)，是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，具有抑菌效果、抗氧化性和對(duì)生物的趨避性等天然特性[23]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用植物精油在果蔬保鮮方面的研究較多。紀(jì)雨薇等[24]研究楓香葉分離物對(duì)枇杷的貯藏保鮮效果，發(fā)現(xiàn)10 mg/100 mL 的楓香葉分離物可以有效控制枇杷果實(shí)腐爛指數(shù)、硬度、細(xì)胞膜滲透性及PAL 活性和POD 活性的升高，延緩可溶性固形物、可滴定酸含量的下降和木質(zhì)素的積累。尚艷雙等[25]研究楓香葉精油對(duì)低溫貯藏枇杷的防腐保鮮效果，得出6 μL/100 mL的楓香葉精油處理可以顯著延緩果實(shí)硬度上升和木質(zhì)素的積累，減少果實(shí)腐爛、質(zhì)量損失和丙二醛含量，減緩可溶性固形物的降低，抑制POD 和PAL 的活性。

本試驗(yàn)在8 ℃貯藏條件下，以未經(jīng)涂膜的枇杷作為對(duì)照，探討不同木姜子濃度的殼聚糖/乳清蛋白膜液對(duì)枇杷冷藏期間木質(zhì)化的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明木姜子精油（6%）/殼聚糖/乳清蛋白膜液涂膜處理枇杷果實(shí)可以明顯降低其水分的散失，提升了其出汁率，維持果實(shí)的硬度，維持貯藏枇杷果實(shí)的品質(zhì)；經(jīng)過(guò)涂膜處理，枇杷果實(shí)MDA 的含量明顯降低，枇杷的膜脂過(guò)氧化作用受到抑制，細(xì)胞膜的完整性得到保護(hù)，延長(zhǎng)了枇杷的貨架期。對(duì)于冷藏枇杷果實(shí)木質(zhì)化影響的研究得出木姜子/殼聚糖涂膜處理可以明顯抑制木質(zhì)素合成相關(guān)的酶PPO、POD、PAL 的活性，進(jìn)而減緩了其木質(zhì)素的合成，降低了其木質(zhì)素的含量，減緩貯藏過(guò)程中冷害的發(fā)生，延長(zhǎng)了枇杷果實(shí)的貨架期，使用6%濃度的木姜子殼聚糖乳清蛋白膜溶液處理組的結(jié)果要明顯優(yōu)于對(duì)照組及其他處理組。