段笑影，曹冬冬，崔 強，陸徐偉，李 文，王虹玲*

（沈陽工學院 生命工程學院，遼寧 撫順 113122）

中藥材狗尾草（Setaria viridis）為禾本科植物狗尾草屬多種植物的總稱又名綠狗尾草、谷莠子[1]。狗尾草中富含多糖和酚類物質，并含有鈣、磷、鎂、鉀、鈉、硫、氯等元素，其種子粒中含有48%～50%的淀粉[2-5]。狗尾草性平、味淡、無毒，具有清熱利濕、祛風明目、解毒、殺蟲等功效，可治療癰腫、瘡癬、赤眼等[6-8]。多酚類物質是植物的主要次生代謝產(chǎn)物之一，多酚通過提供氫原子或螯合劑來抑制氧化作用，使其具有較強的抗氧化能力和清除自由基能力[9-11]，且研究證實多酚類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗血栓形成和抗動脈硬化等重要作用。

目前國內對狗尾草屬的研究主要集中于狗尾草種子活力及其萌發(fā)特性，國外狗尾草中活性物質提取的研究較少。楊楠等[12]利用正交試驗對狗尾草中總黃酮類物質進行提取，得到狗尾草中總黃酮類物質最大提取率為2.20%。

本研究以成熟狗尾草為原料，乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取狗尾草中的多酚，并通過響應面法優(yōu)化提取工藝，確定狗尾草中提取多酚的最佳提取條件，并對狗尾草多酚的體外抗氧化性進行探討，旨為狗尾草的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

狗尾草：于2018年10月采摘于沈陽工學院，新鮮，無病蟲害，烘干磨粉后備用。

1.1.2 藥品試劑

沒食子酸：武漢鼎國生物技術有限公司；乙醇、無水碳酸鈉、福林酚（folin phenol，F(xiàn)C）試劑、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylatedhydroxytoluene，BHT）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：國藥集團化學試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-250E醫(yī)用超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；XS-255A精密電子天平：普利賽斯國際貿易（上海）有限公司；HC-500T2高速多功能粉碎機：永康市天祺盛世工貿有限公司；TGL-18B離心機：上海安亭科學儀器廠；GM0.33A隔膜真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；DGG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 狗尾草中多酚的提取工藝流程

狗尾草種子烘干→去除雜質→粉碎過60目篩→加入乙醇→超聲輔助提取（功率250 W）→真空抽濾→蒸發(fā)濃縮→多酚

1.3.2 沒食子酸標準曲線的繪制[13]

準確稱取沒食子酸標準品0.011 g用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度0.11 mg/mL；精確移取0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于25 mL棕色容量瓶中，分別添加蒸餾水至6.0 mL，然后分別加入福林酚試劑0.5 mL，混勻后加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，充分混勻后定容至刻度，30℃避光放置0.5 h，在波長760 nm處測定其吸光度值，同時用試劑空白為參比液。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 狗尾草提取液中的多酚含量測定

取1.0mL狗尾草提取液按照1.3.2中的方法于波長760nm處測其吸光度值，通過標準曲線回歸方程計算出1.0 mL中樣品的多酚含量，按下式計算得到多酚提取率。

式中：X為多酚提取率，%；m1為1.0 mL提取液中的多酚含量，mg/mL；V1為提取液的總體積，mL；M1為稱取的狗尾草粉末質量，g。

1.3.4 狗尾草提取液工藝優(yōu)化單因素試驗

采用超聲波輔助乙醇法，考察料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間對狗尾草中多酚提取率的影響。

精確稱取5.0 g狗尾草干粉末，置于100 mL燒杯中。分別在不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL）），乙醇體積分數(shù)（55%、60%、65%、70%、75%、80%），提取溫度（55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃），提取時間（70 min、75 min、80 min、85 min、90 min、95 min）條件下進行提取，取1 mL提取液，在波長760 nm處測其吸光度值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算其多酚含量。

1.3.5 狗尾草多酚提取工藝優(yōu)化響應面試驗分析

在單因素試驗結果基礎上，以多酚提取率（Y）為考察指標，以料液比（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為4個因素，每個因素選取3個水平，進行Box-Benhnken試驗設計[14-17]，優(yōu)化狗尾草中多酚類物質的提取工藝。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 狗尾草多酚提取條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization of polyphenols from Setaria viridis

1.3.6 抗氧化活性測定

（1）羥基自由基（OH·）清除率

按照參考文獻[18]的方法進行測定。以BHT作陽性對照，重復測定3次取平均值。OH·清除率計算公式如下：

式中：A1為空白對照組吸光度值；A2為樣品組吸光度值；A3為蒸餾水代替水楊酸的溶液的吸光度值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除測定

按照參考文獻[19]的方法進行測定。以BHT作陽性對照，重復測定3次取平均值。O2-·清除率計算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率=A0-A1+A2

A0×100%

式中：A0為空白對照組吸光度值；A1為樣品組吸光度值；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚的溶液的吸光度值。

（3）DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定

按照參考文獻[20]的方法進行測定。以BHT作陽性對照，重復測量3次取平均值。DPPH·清除率計算公式如下：

式中：A1為樣品組吸光度值；A2為無水乙醇代替DPPH的溶液的吸光度值；A3為空白對照組吸光度值。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

以焦性沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得到標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，標準曲線回歸方程為：y=0.443 9x+0.021 2，相關系數(shù)R2=0.990 6。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對多酚提取率的影響

圖2 料液比對狗尾草多酚提取率的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖2可知，隨著料液比在1∶15～1∶25（g∶mL）的范圍內增大，多酚提取率提高；當料液比達到1∶25（g∶mL）時，多酚提取率達到2.66%；繼續(xù)增大料液比時，多酚提取率提高不顯著；原因可能是開始時溶劑用量增加促進多酚的提取，當溶劑用量達到某一數(shù)值，增加溶劑用量相同的提取時間內提取效果提高不顯著。因此，選取最佳料液比為1∶25（g∶mL）。

2.2.2 乙醇體積分數(shù)對多酚提取率的影響

圖3 乙醇體積分數(shù)對狗尾草多酚提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)在55%～70%范圍內的增加，多酚提取率提高；當乙醇體積分數(shù)為70%時，多酚提取率達到3.34%；再增加乙醇體積分數(shù)，多酚提取率降低；原因可能是不同乙醇體積分數(shù)極性不同，且多酚化合物極性較高，根據(jù)相似相溶原理，多酚在乙醇體積分數(shù)為70%時溶出效率最高。因此，選取最佳乙醇體積分數(shù)為70%。

2.2.3 提取溫度對多酚提取率的影響

圖4 提取溫度對狗尾草多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖4可知，隨著提取溫度在60～75℃范圍內的升高，多酚提取率提高；當提取溫度達到75℃時，多酚提取率達到3.21%；隨著提取溫度繼續(xù)升高，多酚提取率降低；原因可能是多酚提取率隨著溫度升高而增加，但是溫度過高，多酚結構遭到破壞，提取率降低。因此選取最佳提取溫度為75℃。

2.2.4 提取時間對多酚提取率的影響

圖5 提取時間對狗尾草多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖5可知，隨著提取時間在70～80min范圍內的增加，多酚提取率提高；當提取時間為80 min時，多酚提取率達到2.54%；提取時間繼續(xù)增加，多酚提取率降低；原因可能是當提取時間過短時，多酚提取不完全，提取時間過長時，多酚的穩(wěn)定性降低，導致多酚提取率降低。因此選取最佳提取時間為80 min。

2.3 響應面法優(yōu)化提取試驗結果及分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗設計方案與結果見表2，回歸方程方差分析的結果見表3。

根據(jù)Design Expert 8.0.6.1對表2試驗數(shù)據(jù)進行的多元回歸擬合，得到以多酚提取率為響應值的回歸方程：

Y=3.51-0.049A+0.077B+0.035C+0.038D+0.25AB+0.023AC-0.033AD+0.15BC+0.13BD-0.15CD-0.38A2-0.27B2-0.38C2-0.26D2

表2 狗尾草多酚提取條件優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology for extraction conditions optimization of polyphenols from Setaria viridis

由表3可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項不顯著（P＞0.05）；回歸方程調整決定系數(shù)R2adj=0.969 0，決定系數(shù)R2=0.919 8，表明該模型擬合程度較好。在所取的各因素水平范圍內，影響狗尾草多酚提取率因素主次順序為：乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間＞提取溫度，交互項AB、BC、BD、CD 極顯著（P＜0.001）；二次項A2、B2、C2、D2對狗尾草多酚提取率均有極顯著影響（P＜0.001）。

2.3.2 響應面分析及最佳提取工藝研究

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖6 料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間交互作用對狗尾草多酚提取率影響的響應曲面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid to liquid ratio,ethanol volume fraction,extraction temperature and time on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

響應面可直觀反映出各因素對響應值的影響，曲面越陡說明相關因素之間的交互作用越強[21]。從圖6可以看出，各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，即多酚提取率趨向最大化，說明存在最大響應值。運用Design Expert 8.0.6.1軟件對其結果進行分析，當理論響應值最大時，4個因素所對應的最佳值為料液比1∶20.11（g∶mL）、乙醇體積分數(shù)69.73%、提取溫度79.90℃、提取時間75.21min時，在此條件下多酚提取率可達3.499%。

為方便操作，修改最佳條件為料液比1∶20（g∶mL）、乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度80℃、提取時間75 min，對狗尾草多酚提取率進行3次平行試驗，結果顯示多酚提取率平均值為3.234%。該實際值與理論值相近，因此利用響應面優(yōu)化得到的工藝條件具有可行性。

2.4 狗尾草多酚的體外抗氧化活性

2.4.1 對羥基自由基的清除作用

圖7 狗尾草多酚對羥基自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of polyphenols fromSetaria viridison hydroxyl free radicals

由圖7可知，隨著狗尾草多酚和BHT質量濃度的增加，對羥基自由基的清除率均逐漸增大，當質量濃度為1.2 mg/mL時，BHT、狗尾草多酚對羥基自由基的清除率分別為（82.70±4.526）%、（48.56±3.457）%。

2.4.2 對DPPH自由基的清除作用

圖8 狗尾草多酚對DPPH自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of polyphenols fromSetaria viridison DPPH radicals

由圖8可知，隨著狗尾草多酚和BHT質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率均逐漸增大，當質量濃度為0.4mg/mL時，其清除率分別為（65.34±4.190）%和（64.20±4.778）%。

2.4.2 對超氧陰離子自由基的清除作用

圖9 狗尾草多酚對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.9 Scavenging effect of polyphenols fromSetaria viridison superoxide anion radical

由圖9可知，低濃度時（＜0.4 mg/mL），BHT清除超氧陰離子自由基能力高于狗尾草多酚的清除能力。當質量濃度＞0.8 mg/mL以后，狗尾草多酚清除率趨于穩(wěn)定，清除率最大值為（88.05±2.954）%；BHT對超氧陰離子的清除率逐漸增大，最大值為（66.93±4.229）%。

3 結論

本研究以狗尾草為原料提取多酚，以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間為考察因素，以提取率為響應值，在單因素試驗基礎上進行響應面回歸方程確定狗尾草多酚提取工藝的最優(yōu)條件為：料液比1∶20（g∶mL）、乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度80℃、提取時間75 min，在此條件下，狗尾草多酚提取率為3.234%，與理論值3.499%基本一致。影響狗尾草多酚提取率大小的因素順序為乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間＞提取溫度。

抗氧化試驗結果表明，狗尾草多酚可以有效的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基，當樣品質量濃度達到試驗最大濃度時，清除率分別為（48.56±3.457）%、（88.05±2.954）%、（65.34±4.190）%，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。