胡佳星，袁文艷，滿都拉，孫子羽，張璐瑤，陳忠軍*

（內蒙古農業(yè)大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，人們開始追求綠色健康的高品質生活，而富含功能因子的各種果酒，深受消費者的喜愛。藍莓（Vacciniumspp.）屬于杜鵑花科的一類灌木[1]，通常在酸性土壤中生長，在我國藍莓主要分布在大興安嶺地區(qū)附近。藍莓因其含有多種營養(yǎng)因子，如錳元素、維生素B6（vitamin B6，VB6）、VC、VK、花色苷、黃酮和膳食纖維等，被人們譽為“水果皇后”[2-3]，其中最受人關注的便是藍莓中的花青素?；ㄇ嗨刈鳛橐环N黃酮類化合物，具有清除自由基、抗氧化、改善視力、抗增生、減肥和降血脂等功效[4-8]。由于藍莓果易于氧化，不易保存，因此以野生藍莓為原料發(fā)酵的藍莓果酒，不僅可以延長藍莓的保質期，而且能夠有效的保留藍莓的風味及其營養(yǎng)物質。但由于藍莓果汁初始pH較低，普通酵母菌因其耐酸性較差在發(fā)酵過程中，導致藍莓酒起發(fā)速度較慢或發(fā)酵提前終止。陳小玲[9]以篩選得到的野生酵母菌株為發(fā)酵劑，通過采用響應面法優(yōu)化藍莓果酒發(fā)酵工藝，在發(fā)酵初始糖度為25°Bx，酵母接種量為5%，酶添加量0.4%的條件下24℃發(fā)酵8 d后，得到花青素含量為322.58 mg/L、酒精度為12.5%vol的藍莓果酒。謝洋洋[10]以安琪釀酒酵母為發(fā)酵菌株，經單因素、正交試驗確定了發(fā)酵初始pH值為3.3，初始糖度10°Bx，酵母菌接種量0.1%，于25℃發(fā)酵的最佳藍莓果酒發(fā)酵工藝。李婧等[11]利用活性干酵母發(fā)酵藍莓汁，經過皂土澄清，得到了果香濃郁的藍莓果酒，為藍莓果酒的發(fā)酵提供了參考。本試驗利用實驗室篩選的可耐pH值為1.8的耐酸酵母菌株YM1-1和產酯酵母菌株T1作為復合發(fā)酵菌株，通過設計單因素及正交試驗確定藍莓酒最優(yōu)的發(fā)酵工藝[12]，藍莓酒發(fā)酵工藝的探究為工業(yè)化生產提供了參考并奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍莓：內蒙古根河野生資源開發(fā)公司；耐酸酵母菌株YM1-1、產酯酵母菌株T1：本實驗室篩選保藏；白砂糖：市售；鹽酸：天津市致遠化學試劑有限公司；偏重亞硫酸：天津化學試劑三廠；無水乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖：天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司；大豆蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂（均為生化試劑）：南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；果膠酶（酶活為20000U）：煙臺伯爵士酵母有限公司。所用試劑均為分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

FA2104N電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；A-103多功能榨汁攪拌機：浙江順敬工貿有限公司；BKQB100II高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科生物產業(yè)有限公司；PHS-3CpH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PAL-1糖度儀：青島聚創(chuàng)美家環(huán)保技術有限公司；LRH-500F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：濟南來保醫(yī)療器械有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：常州市金壇華偉儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 藍莓酒工藝流程及操作要點

打漿：將藍莓用榨汁機榨得藍莓汁

果膠酶酶解：藍莓汁中添加30 mg/L果膠酶，并于25℃酶解20 min；

浸漬：將酶解得到藍莓汁于35℃水浴浸漬40 min；

離心分離：將上述處理的藍莓汁在5 000 r/min的條件下離心10 min，得到澄清藍莓汁；

成分調整：野生藍莓打漿離心后加水（體積比為1∶1）得到藍莓汁，添加白砂糖調節(jié)初始糖度為12.5°Bx，SO2添加量為60 mg/L；

菌株活化：將斜面保藏的YM1-1菌株和T1菌株，分別在無菌環(huán)境中用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于YEPD培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，將其以2%的接種量接種到YPD液體培養(yǎng)基中，并在28℃恒溫培養(yǎng)48 h，根據以上操作再次進行傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的第3代菌液用于以下試驗；

菌懸液的制備：將10 mL三代菌液在4 000 r/min的條件下離心3 min后倒掉上清液，并用無菌生理鹽水將離心的菌泥進行洗滌，用漩渦儀混合均勻后，依據平板菌落計數的方法，將活菌濃度調整為1×108CFU/mL[13]；

后發(fā)酵：主發(fā)酵得到的藍莓酒于12℃后酵20 d；

穩(wěn)定性處理：通過不斷倒桶和膜過濾實現。

1.3.2 藍莓酒工藝優(yōu)化單因素試驗

（1）SO2添加量對藍莓酒的影響：在接種量為5%，產酯酵母：耐酸酵母為1∶1（V/V），初始pH值為3.0，果膠酶添加量為20 mg/L的條件下，調整SO2添加量分別為30 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、120 mg/L、150 mg/L，24℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標，分析SO2添加量對藍莓酒的影響。

（2）果膠酶添加量對藍莓酒的影響：調整果膠酶添加量分別為20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L，24℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標，分析果膠酶添加量對藍莓酒的影響。

（3）初始pH值對藍莓酒的影響：用檸檬酸和檸檬酸鈉將發(fā)酵醪液初始pH值分別調為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，24 ℃恒溫發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標，分析發(fā)酵初始pH值對藍莓酒的影響。

（4）接種量對藍莓酒的影響：按照藍莓發(fā)酵醪液體積的5%、6%、7%、8%、9%的接種量分別進行接種，于24℃發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標，分析酵母菌接種量對藍莓酒的影響。

（5）接種比例對藍莓酒的影響：產酯酵母∶耐酸酵母接種比例分別為1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1（V/V），于24 ℃發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標，分析接種比例對藍莓酒的影響。

（6）發(fā)酵溫度對藍莓酒的影響：分別于發(fā)酵溫度為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的條件下發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，以花青素含量和感官評分為考察指標，分析發(fā)酵溫度對藍莓酒的影響。

1.3.3 藍莓酒工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，挑選對藍莓酒影響較大的因素設計正交試驗方案，進行綜合研究分析，并確定最佳工藝條件組合。正交試驗因素與水平見表1。

表1 藍莓酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of blueberry wine

1.3.4 測定方法

（1）感官評定方法

邀請13位經過培訓的專業(yè)人員，從酒液外觀、香氣、果渣沉淀狀況、口感四個方面對藍莓酒進行感官評定。感官評分標準見表2。滿為100分，感官評價最終得分為13人評分的平均值[14]。（2）花青素含量：按照參考文獻[15]的方法進行測定。（3）酒精度：用蒸餾法測定；殘?zhí)牵菏褂帽銛y式手持糖度計測定；糖醇轉化率計算公式[18]式中：S為糖醇轉化率，%；C為酒精度，%vol；G為糖度，°Bx。

表2 藍莓酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of blueberry wine

2 結果與分析

2.1 藍莓酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 SO2添加量對藍莓酒品質的影響

圖1 SO2添加量對藍莓酒品質的影響Fig.1 Effect of SO2addition on blueberry wine quality

由圖1可知，隨著SO2添加量的增加，藍莓果酒中花青素含量及其感官評分均呈先上升后下降的趨勢。當SO2添加量為60 mg/L時，感官評分和花青素含量均達到最大值，分別為82分和205.9 mg/L；因為SO2本身具有還原性，適量的SO2對花青素有保護作用，同時可以有效的抑制雜菌生長[17]，但過量的SO2一方面會產生不良的氣味影響藍莓酒的品質；另一方面SO2會與酒中花青素發(fā)生加成反應，使花青素含量降低，同時酒體顏色變淺，影響外觀。因此，選擇最佳SO2添加量為60 mg/L。

2.1.2 果膠酶添加量對藍莓酒品質的影響

圖2 果膠酶添加量對藍莓酒品質的影響Fig.2 Effect of pectinase addition on blueberry wine quality

由圖2可知，當果膠酶添加量為20～60 mg/L時，隨著果膠酶添加量的增加，藍莓酒中花青素含量及感官評分呈先升高后降低趨勢。果膠酶添加量為30 mg/L時，藍莓酒中花青素的含量及感官評分均為最高，分別為230.7 mg/L和85.5分；當果膠酶添加量＜30 mg/L之前，隨著添加量的增加，花青素含量及感官評分顯著性上升（P＜0.05），原因是果膠酶濃度較低沒有使藍莓中果膠物質等充分水解，進而有效成分沒有充分溶出所以花青素含量較低，同時藍莓酒的色澤較淺影響感官；當果膠酶添加量＞30 mg/L之后，由于果膠酶濃度太高，果膠酶酶解破壁反應已經相對徹底，所以過多的果膠酶可能會水解產生其他物質，從而造成花青素含量及感官評分下降[18]。因此，選擇最佳果膠酶添加量為30 mg/L。

2.1.3 初始pH值對藍莓酒品質的影響

圖3 初始pH值對藍莓酒品質的影響Fig.3 Effect of initial pH on blueberry wine quality

由圖3可知，隨著發(fā)酵初始pH的升高，藍莓酒中花青素含量及感官評分均呈現顯著性先上升后下降（P＜0.05）。當pH值為3.5時，藍莓酒中花青素含量以及感官評分均達到最大值，分別為243.8 mg/L和85.6分。這可能是由于發(fā)酵初始pH值對酵母菌的生長繁殖影響較大，不同的發(fā)酵初始pH值不僅會影響酵母代謝而且影響藍莓酒的口感。同時花青素在酸性條件下穩(wěn)定性較好，在中性或者堿性條件下穩(wěn)定性會變差[19]。因此，選擇最佳發(fā)酵初始pH值為3.5。

圖4 接種量對藍莓酒品質的影響Fig.4 Effect of inoculum on blueberry wine quality

2.1.4 接種量對藍莓酒品質的影響由圖4可知，在酵母接種量為5%～9%時，花青素含量及感官評分隨著酵母接種量的增加呈現先上升后下降的趨勢。當接種量為6%時花青素含量和感官評分均較高，分別為253.7 mg/L和86.2分。原因可能是隨著酵母菌接種量的增加酒體中酵母菌的代謝產物也在增加。合適的接種量一方面會產生適量的芳香類代謝產物提高保健酒的品質，另一方面使藍莓酒發(fā)酵速度加快有利于活性物質保留。但過量的酵母菌接種量又會產生不良的酵母味，影響藍莓酒風味，同時花青素會與代謝產物結合[20]，使花青素大量損失。因此，選擇最佳酵母接種量為6%。

2.1.5 酵母接種比例對藍莓酒品質的影響

圖5 酵母接種比例對藍莓酒品質的影響Fig.5 Effect of inoculum ratio on quality of blueberry wine

由圖5可知，隨著藍莓酒中兩種酵母菌的接種比例的變化，藍莓果酒的花青素含量及感官評分均呈現先上升后下降的趨勢，呈現不斷下降的趨勢。在產酯酵母∶耐酸酵母為1∶2（V/V）時，酒中花青素的含量和感官評分均達到最大，分別為279.4 mg/L和87.6分，不同的接種比例對藍莓酒中花青素的含量以及感官評分均有影響，可能是因為接種比例不同發(fā)酵液中最終兩株菌數量不同，產生的代謝產物等不同進而使得最終藍莓酒的風味口感以及花青素含量發(fā)生改變。因此，選擇最佳菌株接種比例為產酯酵母∶耐酸酵母=1∶2（V/V）。

2.1.6 發(fā)酵溫度對藍莓酒品質的影響

圖6 發(fā)酵溫度對藍莓酒品質的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on blueberry wine quality

由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，花青素含量呈現先上升后下降的趨勢，感官評分呈現先下降后上升再下降的趨勢。當發(fā)酵溫度為26℃時，感官評分和花青素含量均達到最大，分別為86.9分和281.7 mg/L。當發(fā)酵溫度低于26℃之前，花青素含量和感官評分均較低，可能原因是當溫度過低時，影響酵母生長代謝速率進而影響藍莓酒酒精度和口感，同時低溫會使花青素溶解度降低，藍莓酒中花青素含量降低；當發(fā)酵溫度高于26℃之后，花青素含量及感官評分均有所下降，由于發(fā)酵溫度過高時，酵母生長代謝過于旺盛[21]，造成糖類未能完全被徹底轉化為酒精，影響口感。同時酵母生長代謝旺盛產生代謝產物過多，花青素會與代謝產物結合使最終發(fā)酵藍莓酒中花青素含量降低，例如酵母菌在發(fā)酵階段產生的丙酮酸、乙醛以及一些酶類會使花青素降解。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為26℃。

2.2 藍莓酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

由表3可知，當以花青素含量為評價指標分析時，各因素對藍莓酒花青素含量的影響次序為初始pH值＞果膠酶添加量＞接種量＞SO2添加量，表明初始pH值對藍莓酒品質的影響最大。最優(yōu)發(fā)酵工藝參數組合為A2B1C1D1，即SO2添加量為60 mg/L，產酯酵母∶耐酸酵母為1∶2（V/V），接種量為5.5%，果膠酶添加量為25 mg/L，發(fā)酵初始pH值為3.2。在此條件下發(fā)酵藍莓酒的花青素含量為350.4 mg/L，感官評分為87分。

當以感官評定為評價指標進行分析時，各因素對藍莓酒感官評分的影響次序為SO2添加量＞接種量=果膠酶添加量=初始pH值，表明SO2添加量對藍莓酒品質的影響最大。結果顯示以感官評分為評定指標的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數組合為A2B2C2D3，即在SO2添加量為60 mg/L，產酯酵母∶耐酸酵母為1∶2（V/V），接種量為6.0%，果膠酶添加量為30 mg/L，發(fā)酵初始pH值為3.8。在此條件下發(fā)酵藍莓酒的花青素含量為368.5mg/L，感官評分為87分。

表3 藍莓酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of blueberry wine

基于驗證試驗結果對比，在組合A2B2C2D3條件下發(fā)酵的藍莓酒感官評分為87分，花青素含量為368.5 mg/L，所以最終選擇組合A2B2C2D3為最優(yōu)發(fā)酵工藝參數組合。

2.3 藍莓酒質量評價

在此條件下發(fā)酵得到果香濃郁、口感醇厚的低酒精度藍莓酒，酒精度為4.2%vol，殘?zhí)菫?.0°Bx，糖醇轉化率為33.6%，花青素含量為368.5 mg/L。

3 結論

本研究以耐酸酵母YM1-1和產酯酵母T1為試驗菌株，藍莓汁與水體積比1∶1，調節(jié)初始糖度為12.5°Bx為發(fā)酵醪液，經單因素及正交試驗確定藍莓酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝為SO2添加量60 mg/L，以產酯酵母∶耐酸酵母接種比例1∶2（V/V），接種量6.0%，果膠酶添加量30 mg/L，發(fā)酵初始pH值3.8的條件下，于26℃發(fā)酵至殘?zhí)菫?.0°Bx，在此優(yōu)化發(fā)酵條件下釀造得到的藍莓保健酒酒精度為4.2%vol，殘?zhí)菫?.0°Bx，感官評分為87分，糖醇轉化率為33.6%，花青素含量為368.5 mg/L。