崔小亮，邵小兵*，鐘和平，葛 隱，楊 洋，張 賀

（宜賓長(zhǎng)江源酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川 宜賓 643000）

酵母菌是白酒生產(chǎn)過程中的主要功能微生物，其在淀粉的糖化、酒精的生成、香氣物質(zhì)的形成、酒醅的發(fā)酵及終產(chǎn)品品質(zhì)等方面都起著重要的作用[1]。因地域、環(huán)境、氣候、工藝等不同，不同香型白酒釀造過程中，酵母菌群種類分布有一定差異。如濃香型白酒酵母菌種類主要有產(chǎn)酯酵母、假絲酵母、釀酒酵母、接合酵母及伊薩酵母等[2-5]；醬香型白酒酵母菌主要有扣囊復(fù)膜酵母、異常畢赤酵母、檸檬形接合酵母、東方伊薩酵母及畢赤酵母等[6-8]；清香型白酒酵母菌種類主要有釀酒酵母、漢遜酵母及少量的假絲酵母[9]。

目前，釀酒行業(yè)研究的酵母菌主要是從大曲、窖泥、糟醅及環(huán)境中分離篩選，根據(jù)其特性及主要代謝產(chǎn)物種類將其分為釀酒酵母及產(chǎn)香酵母兩大功能類別[10-11]。其中釀酒酵母糟醅中主要的乙醇產(chǎn)生菌，產(chǎn)酯酵母菌對(duì)基酒中主要酯類比例起著主要作用。只有兩類酵母菌具有適當(dāng)?shù)谋壤洼^高的活性，才能保證糟醅中產(chǎn)乙醇和產(chǎn)酯反應(yīng)順利進(jìn)行，同時(shí)糟醅中較高的乙醇含量能夠抑制雜菌的過度生長(zhǎng)，從而使糟醅酸度控制在適當(dāng)范圍。但是由于生產(chǎn)管理不當(dāng)、菌群比例不斷變化等問題導(dǎo)致白酒生產(chǎn)行業(yè)長(zhǎng)期普遍存在出酒率低、糟醅酸高、基酒主要酯類比例失調(diào)等問題，嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)品質(zhì)量的進(jìn)一步提升[12]。

近年來酵母菌在釀酒中的研究主要集中在酵母菌的產(chǎn)酒功能、產(chǎn)酯功能等，同時(shí)伴隨著耐酸、耐熱等能力研究[13-14]。本研究從曲藥、糟醅、窖泥、輔料抽取多個(gè)樣品，全面分析多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中可培養(yǎng)酵母菌多樣性，基于ITS rDNA序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其進(jìn)行鑒定；采用酒精度快速測(cè)定儀及氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS）法分別檢測(cè)菌株發(fā)酵液乙醇含量及酯含量，借此篩選優(yōu)質(zhì)釀酒功能酵母菌，并考察其發(fā)酵特性。期望通過對(duì)白酒生產(chǎn)過程中酵母菌的研究，為多糧濃香型白酒產(chǎn)質(zhì)量提高提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從五糧液制曲車間、釀酒車間取樣11個(gè)，其中大曲3個(gè)、糟醅3個(gè)、窖泥3個(gè)、輔料2個(gè)。

1.1.2 試劑

酵母菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒（B639285）：生工生物工程（上海）股份有限公司；無(wú)水葡萄糖（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：天津大茂化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基：麥芽汁130.1g，加水定容至1000mL，121℃滅菌20 min，備用。

麥芽汁固體培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，麥芽汁130.1g，加水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，倒平板，備用。

麩皮培養(yǎng)基：5%麩皮煮沸1 h，用紗布過濾掉麩皮后加入葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F100搖床、LRH-250恒溫培養(yǎng)箱、HW326恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DM-500顯微鏡：日本尼康公司；4920 000.016移液槍：德國(guó)Eppendorf公司；M367983 PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)伯樂公司；Dyy-12電泳儀：北京市六一儀器廠；MOD.Super Alcomat酒精度快速測(cè)定儀：意大利GIBERTINI公司；ZF-670凝膠成像系統(tǒng)：上海嘉鵬科技有限公司；6890N-5973氣相色譜-質(zhì)譜儀：美國(guó)安捷倫公司；LD5-2A離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；SJIA-10N-50A冷凍干燥機(jī)：上海秋佐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分離純化與保藏

稱取5.00 g樣品，倒入裝有50 mL已滅菌麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，160～180 r/min、28℃富集培養(yǎng)24 h。按10倍稀釋法對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋，移取稀釋液0.5 mL均勻涂布于麥芽汁固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫倒置培養(yǎng)48～72 h。挑取單菌落在麥芽汁固體培養(yǎng)基上純化1～2次，獲得純化菌株[15]。

純化菌株采用麥芽汁固態(tài)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)短時(shí)間保存[16]，用冷凍干燥機(jī)將菌株冷凍干燥，保護(hù)劑為20%甘油，預(yù)凍溫度為-80℃，預(yù)凍時(shí)間為3 h，凍干時(shí)間為8 h，菌株干粉在-80℃條件下長(zhǎng)期保存。

1.3.2 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)觀察

將篩選到的酵母菌接種在麥芽汁固體平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2d，觀察并記錄酵母菌株在麥芽汁固體培養(yǎng)基上的菌落及細(xì)胞形態(tài)。

（2）菌株的分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：按照上海生工酵母菌基因組DNA抽提試劑盒說明書的實(shí)驗(yàn)步驟提取目的菌株的總DNA。

ITS rDNA序列擴(kuò)增與序列分析：上游引物ITS1：5′CTTggTCATTTAgAggAAgTAA3′；下游引物 ITS4：5′TCCTCCgCTTATTgATATgC3′。PCR擴(kuò)增體系（50μL）：ddH2O 22 μL，2×PCR master 25 μL，Primer 1 2 μL，Primer 2 2 μL，模板1μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72 ℃、1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min。

擴(kuò)增的ITS rDNA序列產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechonology information，NCBI）網(wǎng)站用基本局部比對(duì)搜素工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行序列比對(duì)，通過MEGA5軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 優(yōu)質(zhì)功能酵母菌篩選

將分離到的酵母菌分別接種于麩皮培養(yǎng)基，接種量5%，裝液量250 mL/500 mL，28℃、160～180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，分別用酒精度快速測(cè)定儀測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量[17-18]，用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法測(cè)定發(fā)酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯含量[19-20]。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60m×250μm，0.25 μm）；手動(dòng)無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230℃；程序升溫：初始溫度40℃，保留1 min，以3℃/min的速率升至180℃，再以2.5℃/min的速率升至230℃，保留10 min；汽化室溫度230℃；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍20～500 u，離子源溫度250℃；接口溫度230℃。

1.3.4 功能酵母菌的發(fā)酵特性

將初篩到的4株酵母菌分別接種于麩皮培養(yǎng)基，接種量5%，裝液量250mL/500mL，于溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH值分別為2、3、4、5、6條件下160～180r/min振蕩培養(yǎng)72 h后分別用酒精度快速測(cè)定儀測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量，用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法測(cè)定發(fā)酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯含量，考察功能菌株在不同發(fā)酵溫度及pH值條件下的發(fā)酵特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離純化及形態(tài)特征

從多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中多次取樣，經(jīng)過反復(fù)分離純化，共分離出43株酵母菌，曲藥中得到15株酵母菌，糟醅中得到17株酵母菌，窖泥中得到7株酵母菌，輔料中得到4株酵母菌。通過麥芽汁培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征和菌落散發(fā)出的氣味特性，將篩選到的酵母菌分為12種類型，分別編號(hào)為WY1（6株，編號(hào)為WY1-1～6）、WY2（6株，編號(hào)為WY2-1～6）、WY3（2株，編號(hào)為WY3-1～2）、WY4（6株，編號(hào)為WY4-1～6）、WY5（3株，編號(hào)為WY5-1～3）、WY6（5株，編號(hào)為WY6-1～5）、WY7（1株，編號(hào)為WY7-1）、WY8（2株，編號(hào)為WY8-1～2）、WY9（7株，編號(hào)為WY9-1～7）、WY10（3株，編號(hào)為WY10-1～3）、WY11（1株，編號(hào)為WY11-1）、WY12（1株，編號(hào)為WY12-1）。12種類型酵母菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1和表1。

圖1 多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中可培養(yǎng)酵母菌菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of cultivatable yeast during the production of multi-grain strong-flavorBaijiu

表1 多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中可培養(yǎng)酵母菌菌落及細(xì)胞形態(tài)特征Table 1 Colony and cell morphological characteristics of cultivatableyeast during the production of multi-grain strong-flavorBaijiu

在分離純化菌株基礎(chǔ)上，通過有效分析多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中可培養(yǎng)酵母菌多樣性，為后續(xù)菌株的分子生物學(xué)鑒定和優(yōu)質(zhì)功能酵母菌篩選奠定基礎(chǔ)。

2.2 酵母菌分子生物學(xué)鑒定

在酵母菌菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)觀察基礎(chǔ)上，從12種形態(tài)類型中各選擇1株綜合特征能夠代表本類酵母菌、長(zhǎng)勢(shì)健壯的模式菌株，提取其總DNA并進(jìn)行ITS rDNA基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

圖2 酵母菌基于ITS rDNA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products based on ITS rDNA gene sequence of yeasts

由圖2可知，12株酵母菌的ITS rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)雜條帶，且均在500～750 bp之間，這與目的DNA序列大小一致，說明引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增體系合理，擴(kuò)增效果比較理想，無(wú)需進(jìn)行純化，可直接送測(cè)序公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，用DNAMAN8.0軟件將上述序列與擴(kuò)增的ITS序列進(jìn)行序列比對(duì)，并輔以人工修剪將開始和末尾處長(zhǎng)短不同的序列剪切整齊，基于Kimura雙參數(shù)模型，用MEGA5軟件中的鄰接（NJ）法進(jìn)行系統(tǒng)關(guān)系分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于ITS rDNA序列構(gòu)建的多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中可培養(yǎng)酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of cultivable yeasts during the production of multi-grain strong-flavorBaijiubased on ITS rDNA sequences

由圖3可知，系統(tǒng)發(fā)育樹共分為8個(gè)分支，從上到下依次為第1～8分支，其中菌株WY1和WY3位于第1分支，菌株WY2、WY6和WY9位于第7分支，菌株WY11和WY12位于第8分支，其他篩選菌株與各自模式菌株位于同一分支，系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果與擴(kuò)增的ITS序列測(cè)序結(jié)果在NCBI比對(duì)的同源性鑒定結(jié)果趨于一致。

一般Bootstrap值達(dá)到95以上可以判斷二者是同一種，因此本研究系統(tǒng)發(fā)育樹前7個(gè)分支同一分支上的酵母菌可初步判定為同一種，第8個(gè)分支上的酵母菌可以鑒定到屬。結(jié)合篩選酵母菌與模式酵母菌的形態(tài)和生理特性，篩選到的12種形態(tài)類型酵母菌被鑒定為8種酵母菌，具體如下：①菌株WY1和WY3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；②菌株WY2、WY6和WY9為庫(kù)德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；③菌株WY11和WY12為羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）；④菌株WY4為海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）；⑤菌株WY7為拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）；⑥菌株WY5為扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）；⑦菌株WY8為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）；⑧菌株WY10為季也蒙畢赤酵母（Galactomyces geotrichum）。

2.3 功能酵母菌篩選

行業(yè)內(nèi)大量研究證明，白酒生產(chǎn)中主要功能酵母菌為假絲酵母、釀酒酵母、接合酵母、嗜殺酵母、伊薩酵母、扣囊復(fù)膜酵母、畢赤酵母等[5]。因此結(jié)合2.2中鑒定結(jié)果，選取菌株WY1和WY3、WY4、WY5、WY2、W6和WY9、WY10共6類酵母菌，探索其乙醇發(fā)酵特性和產(chǎn)酯特性。由于每個(gè)類別都包含有多個(gè)菌株，只列出在每個(gè)組別酵母菌中性狀表現(xiàn)較好的菌株，結(jié)果見表2。

表2 13株酵母菌發(fā)酵液產(chǎn)乙醇和產(chǎn)酯（己酸乙酯和乙酸乙酯）測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of ethanol and ester(ethyl caproate and ethyl acetate)production in the fermentation broth of 13 yeasts

由表2可知，菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2發(fā)酵液中乙醇含量分別為13%vol、9%vol、9%vol，顯著高于其他菌株乙醇產(chǎn)量，最高可達(dá)6.5倍；菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1發(fā)酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯總含量分別為438 mg/100 mL、521 mg/100 mL、341 mg/100 mL，顯著高于其他菌株發(fā)酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯總含量，最高可達(dá)40倍。因此篩選菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2進(jìn)一步研究發(fā)酵溫度和pH值對(duì)其乙醇發(fā)酵特性的影響；篩選菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1進(jìn)一步研究發(fā)酵溫度和pH值對(duì)其產(chǎn)酯特性的影響[21-22]。

2.4 功能酵母菌的發(fā)酵性能

研究發(fā)酵溫度和pH值對(duì)菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2乙醇發(fā)酵特性的影響以及對(duì)菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1產(chǎn)酯特性的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4a、4c可知，3株產(chǎn)乙醇特性較好的酵母菌都具有一定的耐酸性，在pH值為3的環(huán)境中依然能保持產(chǎn)乙醇能力，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3株菌的發(fā)酵液中乙醇含量保持2%vol以上，菌株WY5-1具有較好的溫度適應(yīng)性，且乙醇產(chǎn)生能力較強(qiáng)。菌株WY3-2在較低溫度條件下具有一定的乙醇產(chǎn)生能力，這兩個(gè)菌株可作為強(qiáng)化功能菌株應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，有目的性的快速積累大量的乙醇，從而隨著發(fā)酵溫度的升高，通過乙醇抑制雜菌的生長(zhǎng)。

由圖4b、4d可知，菌株WY4-1、WY6-3、WY9-2這3株菌都具有一定的溫度適應(yīng)性，在20℃低溫和35℃高溫環(huán)境中具有己酸乙酯、乙酸乙酯產(chǎn)生能力，在適宜的溫度環(huán)境中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3株菌的發(fā)酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯總含量保持400 mg/100 mL以上，菌株WY9-2產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，最高可達(dá)552 mg/100 mL，菌株WY6-3次之，但是3株菌的酸度耐受性稍差。

圖4 溫度和pH值對(duì)酵母菌發(fā)酵液中乙醇和酯含量的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on ethanol and ester contents in the yeast fermentation broth

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹及可培養(yǎng)酵母菌篩選情況，菌株WY6、WY9和WY2三者具有很近的親緣關(guān)系，ITS rDNA相似度為99%，且在本研究所篩選酵母菌中占有較高的比例，菌株WY6、WY9和WY2三類酵母菌共有18株菌，占所篩選酵母菌的42%，從而有效解釋濃香型白酒生產(chǎn)中乙酸乙酯偏高的原因。

3 結(jié)論

通過ITS序列擴(kuò)增、測(cè)序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，本研究得到的12種形態(tài)類型酵母菌被鑒定為8種酵母：菌株WY2、WY6、WY9為庫(kù)德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；菌株WY1、WY3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌株WY4為海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）；菌株WY5為扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）；菌株WY7為拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）；菌株WY8為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、菌株WY10為季也蒙畢赤酵母（Galactomyces geotrichum）、菌株WY11、WY12為羅倫隱球酵母（Cryptococcuslaurentii）。

功能酵母菌篩選結(jié)果表明，扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）WY5-1和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WY3-2具有良好的產(chǎn)乙醇特性；庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）WY6-3和WY9-2具有良好的產(chǎn)酯特性。菌株WY5-1具有較好的溫度適應(yīng)性，且乙醇產(chǎn)生能力較強(qiáng)，WY3-2在較低溫度條件下具有一定的乙醇產(chǎn)生能力，在20℃的環(huán)境中發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液乙醇含量保持4%vol以上。菌株WY4-1、WY6-3、WY9-2這3株菌都具有一定的溫度適應(yīng)性，但是3株菌的酸度耐受性稍差，菌株WY9-2產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，最高可達(dá)552 mg/100 mL，菌株WY6-3次之，最高含量為493 mg/100 mL。

本研究最終篩選到2株產(chǎn)乙醇特性較好菌株，扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）WY5-1和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WY3-2；2株產(chǎn)己酸乙酯、乙酸乙酯特性較好的菌株，庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）WY6-3和WY9-2。4株功能酵母菌均具有較好的溫度適應(yīng)性和一定的酸度耐受性，下一步通過深入研究?jī)?yōu)化這4株菌的生長(zhǎng)特性和代謝產(chǎn)物，并探索不同種類酵母菌的相互作用關(guān)系，以期為白酒生產(chǎn)產(chǎn)質(zhì)進(jìn)一步提升提供理論基礎(chǔ)。