唐 娟 許可心 朱英蓮 劉 璇 郭麗萍

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266109）

十字花科芽苗菜，如西蘭花芽苗、蘿卜芽苗、甘藍芽苗等因為含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，在歐美、日本等國家已經(jīng)成為一種新興的具有保健功能的食品[1-3]。 甘藍是我國食用頻率較高的蔬菜之一，營養(yǎng)價值較高，含有豐富的維生素B1、維生素B2、類胡蘿卜素和鈣、鐵等礦物質(zhì)及膳食纖維。此外，還含有豐富的活性成分，如酚類物質(zhì)、抗壞血酸、花色苷和硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）等[4-5]。 硫苷是十字花科植物中特有的一類含硫的次生代謝產(chǎn)物， 在黑芥子酶的作用下生成的產(chǎn)物之一異硫氰酸酯具有顯著的抗癌、抗炎、抑菌、預(yù)防心腦血管疾病等生理活性[6]。

研究表明，甘藍中硫苷含量顯著高于白菜、芥菜和蘿卜[7]。 甘藍的價格低于西蘭花；甘藍種子是開發(fā)芽苗菜的良好原料。芽苗菜采后迅速老化，貨架期較短，制約了其工業(yè)化生產(chǎn)[8]。 目前對于芽苗菜采后生理生化變化及保鮮方面的研究相對較少。鈣離子在植物生長中起著重要的作用，可以激活植物體內(nèi)的酶類，提高膜穩(wěn)定性。 研究發(fā)現(xiàn)，鈣處理可以延緩水果和蔬菜貯藏過程中的果實的成熟和葉片的衰老，保持細胞膜的完整性[9]。 Kou 等[8]通過采前CaCl2處理提高了西蘭花芽苗菜的生物量和抗氧化酶活性，延緩西蘭花芽苗菜的衰老，并保護細胞壁完整性，從而延長其貨架期。 CaSO4作為一種含硫的化合物是否有利于甘藍芽苗菜中硫苷的合成，以及是否能夠延緩其衰老，提高甘藍芽苗菜的質(zhì)量尚未見報道。

本文通過外源噴施CaSO4處理， 研究了甘藍芽苗菜在貯藏過程中抗壞血酸、總酚、抗氧化酶活性、硫苷、異硫氰酸酯和黑芥子酶活性的變化，旨在推動甘藍芽苗菜的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍種子：購于壽光市城區(qū)蔬菜種子公司。

Sinigrin 標準品、蘿卜硫素標準品、硫酸酯酶、抗壞血酸，美國Sigma 公司；DEAE Sephadex TMA-25 離子交換樹脂、咪唑，北京索萊寶科技有限公司；二氯甲烷、沒食子酸、Folin-酚、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、沒食子酸，國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純），上海陸都化學(xué)試劑廠；葡萄糖測定試劑盒、T-AOC 試劑盒、T-SOD 測定試劑盒，南京建成生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 液相色譜儀， 美國安捷倫公司；TDL-40B 離心機， 上海安亭科學(xué)儀器廠；WFL UV-2000 紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司； Anke TDL-5 飛鴿牌離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；AE100 電子秤，上海天達儀器有限公司；PHS-3C 精密pH 計，上海雷磁儀器廠；光照培養(yǎng)箱， 上海高致精密儀器有限公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋，龍口市尼科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘藍芽苗菜的處理 將甘藍種子消毒后，于30 ℃浸泡4 h， 然后將種子均勻撒至鋪有蛭石的育苗盤中， 將其置于16 h 光照/8 h 黑暗循環(huán)的培養(yǎng)箱中于25 ℃下培養(yǎng)， 每8 h 噴蒸餾水1 次，1 d 后進行處理； 根據(jù)前期試驗結(jié)果，CaSO4的濃度為10 mmol/L，每天噴施2 次，對照噴施蒸餾水，播種9 d 后收獲，去根，將其分別用保鮮膜包裹后于4 ℃冰箱貯藏，分別于0，5，10 和15 d 取樣進行分析。

1.3.2 電解質(zhì)滲透率的測定 根據(jù)Dionisio-Sese等[10]的方法略加修改。 稱取0.5 g 芽苗葉、莖分離，莖切成3 mm 的長度，葉和莖一起浸入30 mL 去離子水中， 于25 ℃振蕩1 h 后， 測定電導(dǎo)率記為EC1，然后在沸水中煮10 min，以殺死植物組織，冷卻后調(diào)整體積為30 mL， 測定煮沸電導(dǎo)率記為EC2。

電解質(zhì)滲透率（%）=（EC1/EC2）×100

1.3.3 抗壞血酸的測定 采用王志英等[5]的方法進行測定，結(jié)果以mg/100 g 鮮重表示。

1.3.4 總酚含量的測定 根據(jù)參考文獻[11]，取0.4 g 芽苗， 用50%甲醇研磨勻漿后10 000 g 離心，取1 mL 上清液，加入1 mL 0.2 mol/L 福林酚試劑和2 mL 2% Na2CO3溶液， 避光反應(yīng)2 h 后，于765 nm 處測定吸光值。 用沒食子酸作標準曲線，計算總酚含量。

1.3.5 總抗氧化能力的測定 總抗氧化能力用南京建成生物工程公司的T-AOC 試劑盒進行測定。

1.3.6 抗氧化酶活性的測定 抗氧化酶的提取參照de Azevedo 等[12]的方法稍作修改。 稱取樣品0.50 g， 用5 mL 預(yù)冷的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0， 含0.1 mmol/L EDTA，1%聚乙烯吡咯烷酮）冰浴研磨勻漿，于16 000 g 冷凍離心20 min，上清液即為粗酶液。 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）根據(jù)T-SOD 測定試劑盒進行，酶活性單位 （U）記為1 mg 蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD 量。過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的測定根據(jù)de Azevedo等[12]的方法，以反應(yīng)液每分鐘在240 nm 波長處吸光值變化0.001 為1 個酶活力單位。 過氧化物酶（peroxidase，POD）采用愈創(chuàng)木酚法[13]測定，以1 mg 組織蛋白1 min 內(nèi)在470 nm 處的吸光度降低0.01 為1 個酶活單位（U）。

1.3.7 硫苷含量的測定 根據(jù)王志英等[5]的方法進行， 甘藍芽苗菜經(jīng)滅酶提取后， 經(jīng)DEAE SephadexTM A-25 離子交換柱進行分離， 加入200 μL 硫酸酯酶脫硫處理后，用HPLC 進行分析，以苯甲基硫苷作為內(nèi)標。

1.3.8 異硫氰酸酯的測定 參考趙功玲等[14]的方法略加修改。取0.5 g 樣品，加入4 mL 水研磨至勻漿，于37 ℃下水解3 h 以徹底釋放異硫氰酸酯，然后加入3 mL 二氯甲烷萃取30 min，10 000 g 離心15 min。 取二氯甲烷層200 μL，依次加入2 mL 甲醇，1.8 mL pH 8.5 的硼砂緩沖液，200 μL 1，2-苯二硫醇8 nmol/L 的1，2-苯二硫醇的甲醇溶液，于65 ℃水浴反應(yīng)1 h 后在365 nm 處測定吸光值。 用蘿卜硫素作標準曲線， 根據(jù)標準曲線計算出樣品異硫氰酸酯生成量。

1.3.9 黑芥子酶活性的測定 根據(jù)參考文獻[11]的方法進行測定。 以每分鐘被黑芥子酶轉(zhuǎn)化生成1 nmol 葡萄糖為1 個酶活力單位， 酶活單位為U/mg protein。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗設(shè)3 次重復(fù)，各指標重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值（means）± 標準偏差（SD）表示。 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件18.0 （SPSS， 18.0）進行統(tǒng)計分析，均值間比較采用Duncan’s 多重比較，設(shè)置顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中電解質(zhì)滲透率的影響

由圖1 可以看出， 在貯藏過程中甘藍芽苗菜的電解質(zhì)滲透液逐漸增加，CaSO4處理下的芽苗菜中電解質(zhì)滲透液顯著低于對照。 在新鮮的芽苗菜中，電解質(zhì)滲透液無顯著差異，貯藏15 d 后，CaSO4處理下芽苗菜中電解質(zhì)滲透液較對照低33.9%。

2.2 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中抗壞血酸和總酚含量的影響

甘藍芽苗菜中抗壞血酸含量在貯藏過程中不斷下降，CaSO4處理顯著延緩了抗壞血酸含量的降低（圖2a）；貯藏15 d 后，對照和CaSO4處理下的芽苗中抗壞血酸含量較初始分別降低了67.0%和45.2%。 但是，甘藍芽苗菜中總酚含量在貯藏過程中卻不斷增加（圖2b），在新鮮的芽苗中，CaSO4處理組低于對照；而貯藏15 d 后，CaSO4處理下的芽苗中抗壞血酸含量較對照組高23.5%。

圖1 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中電解質(zhì)滲透率的影響Fig.1 The effect of CaSO4 treatment on electrolyte leakage of cabbage sprouts during storage

圖2 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中抗壞血酸（a）和總酚（b）含量的影響Fig.2 The effect of CaSO4 treatment on the contents of ascorbic acid and total phenoics in cabbage sprouts during storage

2.3 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中抗氧化酶活性的影響

采前CaSO4處理顯著提高了甘藍芽苗菜的抗氧化酶活性。 其中，隨著貯藏時間的推移，SOD 活性不斷下降，CaSO4處理較對照提高了芽苗的SOD 活性； 在0 和15 d，CaSO4處理的芽苗菜中SOD 活性分別是對照的1.21 倍和3.09 倍。對照組芽苗中POD 活性在貯藏過程中呈增強趨勢，而CaSO4處理的芽苗菜中POD 活性在整個貯藏期間無顯著變化， 無論新鮮的芽苗還是貯藏過程中，CaSO4處理下芽苗菜的POD 活性均顯著高于對照。 在貯藏過程中，對照組芽苗的CAT 活性逐漸下降， 而CaSO4處理組的CAT 活性無顯著變化，貯藏15 d 后，CaSO4處理的芽苗中CAT 活性是對照的1.95 倍。

2.4 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中硫苷含量的影響

如圖4 所示， 在甘藍芽苗菜中共檢測到7 種硫苷， 其中4 種脂肪硫苷 （GIB、PRO、SIN 和GNA），2 種吲哚族硫苷（4HGB 和GB）和1 種芳香族硫苷（GNT）；含量最多的硫苷為3-甲基亞磺酰基丙基硫苷（GIB），2-丙烯基硫苷（SIN）次之。 除PRO 和GB 外， 新鮮芽苗菜中其它硫苷經(jīng)CaSO4處理后均顯著提高。在貯藏過程中，芽苗菜中總硫苷和每種硫苷含量均顯著下降，CaSO4處理阻礙了其下降速度。 貯藏15 d 后，對照和CaSO4處理下的芽苗菜中GIB 分別下降了78.4%和53.8%、SIN 下降了76.1%和65.8%， 總硫苷分別下降了76.5%和61.2%。

圖3 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中抗氧化酶活性的影響Fig.3 The effect of CaSO4 treatment on the activity of antioxidant enzyme in cabbage sprouts during storage

圖4 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中硫苷含量的影響Fig.4 The effect of CaSO4 treatment on glucosinolate content in cabbage sprouts during storage

2.5 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中黑芥子酶活性的影響

圖5 結(jié)果表明， 在貯藏過程中甘藍芽苗菜中黑芥子酶活性不斷降低，CaSO4處理顯著減慢了其降低速度； 新鮮芽苗中黑芥子酶活性在對照和CaSO4處理下無顯著差異，貯藏15 d 后，CaSO4處理下黑芥子酶活性較對照高74.4%。

2.6 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中異硫氰酸酯含量的影響

從圖6 可以看出， 甘藍芽苗中異硫氰酸酯含量在貯藏過程中不斷下降，CaSO4處理提高了新鮮甘藍芽苗中異硫氰酸酯含量， 并阻礙了貯藏過程中其含量的下降速度。 貯藏15 d 后， 對照和CaSO4處理下芽苗中異硫氰酸酯含量分別較新鮮芽苗降低66.9%和40.9%。

圖5 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中黑芥子酶的影響Fig.5 The effect of CaSO4 treatment on myrosinase activity in cabbage sprouts during storage

圖6 CaSO4 處理對甘藍芽苗菜貯藏過程中異硫氰酸酯含量的影響Fig.6 The effect of CaSO4 treatment on isothiocyanate content in cabbage sprouts during storage

3 討論

甘藍芽苗菜具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，雖然在我國還鮮見食用，但已引起研究者的重視。 但是其貨架期較短，因此難以大量生產(chǎn)，影響其開發(fā)利用。 鈣對植物的生長發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，并能活化某些酶類，提高膜穩(wěn)定性。 電解質(zhì)滲透率是表示細胞膜損傷的主要指標之一， 能夠反映細胞的完整性[15]。 KOU 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，外源CaCl2處理后，西蘭花芽苗菜的電解質(zhì)滲透率顯著降低。 本研究中，CaSO4處理甘藍芽苗菜也得到了相似的結(jié)果，表明這主要是Ca2+所起的作用。 抗壞血酸和酚類物質(zhì)是重要的抗氧化成分， 能夠清除過量的自由基。 本研究中甘藍芽苗中抗壞血酸含量在貯藏過程中不斷降低，這與胡花麗等[16]在獼猴桃貯藏過程中的研究結(jié)果一致； 原因是與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)過程中的抗壞血酸過氧化物酶、脫氫抗壞血酸還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶的增加有關(guān)。 湯月昌等[17]發(fā)現(xiàn)，西蘭花在貯藏過程中總酚含量不斷增加， 這與甘藍芽苗菜中的研究結(jié)果一致。 采前CaSO4處理降低了甘藍芽苗中總酚含量， 在貯藏的前10 d 與對照無顯著差異， 而貯藏15 d 后CaSO4處理的芽苗中總酚含量顯著高于對照； 這可能與苯丙氨酸解氨酶的活性有關(guān)， 因為苯丙氨酸解氨酶是酚類物質(zhì)合成過程中的重要酶[17]。

蔬菜和水果采后衰老源于活性氧的積累，由于活性氧產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞， 使其衰老加劇。 SOD、POD 和CAT 是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除活性氧，防止果實的衰老。 貯藏過程中， 西蘭花芽苗菜的SOD 活性不斷下降，而POD 活性逐漸增強[8]，這與本研究結(jié)果一致；但是CAT 活性在西蘭花芽苗菜中逐漸增強， 在本研究中卻呈現(xiàn)下降趨勢。 湯月昌等[17]研究表明，在西蘭花衰老過程中，CAT 活性呈現(xiàn)上升趨勢。而田平平等[18]在杏鮑菇的研究中發(fā)現(xiàn)，CAT 活性呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢。因此，CAT 活性在果蔬貯藏中的變化與果蔬種類有很大關(guān)系， 具體原因還有待于進一步研究。KOU 等[8]研究表明，采前CaCl2處理顯著提高了西蘭花芽苗的SOD、POD 和CAT活性； 本研究中，CaSO4處理也顯著提高了甘藍芽苗中SOD、POD 和CAT 的活性， 表明Ca2+可以提高植物中抗氧化酶的活性。

硫苷作為十字花科植物中特有的一類含硫物質(zhì)， 在植物防御和抵抗脅迫過程中起重要作用[4]。眾多研究者試圖通過施加硫肥提高植物的硫苷含量，Pérez-Balibrea 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，15，30，60 mg/L的K2SO4提高了9 d 和12 d 西蘭花芽苗中硫苷的含量。 Yang 等[20]研究表明，ZnSO4提高了新鮮西蘭花芽苗中硫苷含量，但是降低了其生物量。 Sun等[21]發(fā)現(xiàn)CaCl2也提高了新鮮西蘭花中硫苷含量。而CaSO4兼具硫肥和鈣的雙重作用， 顯著提高了新鮮甘藍芽苗中硫苷含量， 具體機理還需要進一步研究。 西蘭花芽苗在貯藏過程中，硫苷含量不斷下降，并抑制了貯藏過程中硫苷含量的降低[21]。 本研究中CaSO4也顯著延緩了各種硫苷含量的降低速度。 異硫氰酸酯是脂肪族硫苷和芳香族硫苷在黑芥子酶的作用下形成的產(chǎn)物之一， 具有顯著的抗癌作用，因此引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。 在本文的甘藍芽苗菜中， 能形成異硫氰酸酯的硫苷有GIB、SIN、GNA 和GNT， 雖然PRO 也是脂肪族硫苷， 但其產(chǎn)物是人體有害的5-乙烯噁唑烷-2-硫酮[5]。在甘藍芽苗菜貯藏過程中，CaSO4處理下甘藍芽苗菜中異硫氰酸酯含量顯著高于對照， 這是由于其前體物質(zhì)（GIB、SIN、GNA 和GNT）含量的增加和黑芥子酶活性的增強所致。

4 結(jié)論

采前CaSO4處理降低了甘藍芽苗菜的電解質(zhì)滲透液， 保護了其細胞膜的完整性； 在貯藏過程中，甘藍芽苗菜中抗壞血酸含量逐漸下降，而總酚含量逐漸增加；CaSO4處理顯著抑制了甘藍芽苗菜中抗壞血酸含量的降低，提高了總酚含量。 同時，CaSO4處理顯著提高了抗氧化酶SOD、POD 和CAT 的活性。

CaSO4處理顯著提高了新鮮甘藍芽苗菜中GIB、GNT、4HGB、SIN 和GNA 5 種硫苷的含量，同時抑制了所有硫苷在貯藏過程中的降低速度；黑芥子酶活性和異硫氰酸酯含量經(jīng)CaSO4處理后也顯著增加。 這些結(jié)果表明，采前CaSO4處理可以提高甘藍芽苗菜的質(zhì)量，有效延緩其衰老，延長貨架期， 對甘藍芽苗菜的開發(fā)和利用具有非常重要的現(xiàn)實意義。