羅 磊 姬青華 馬麗蘋 樊金玲 朱文學(xué) 關(guān)寧寧 薛依涵

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南省食品原料工程技術(shù)研究中心 河南洛陽471023）

綠豆（Phaseolus radiatus L.）又名青小豆，為豆科草本植物綠豆的種子[1]。 綠豆皮，中醫(yī)稱為綠豆衣，占綠豆總質(zhì)量的7%～10%。研究表明綠豆皮中含有豐富的黃酮類化合物、鞣質(zhì)、皂甙生物堿、強(qiáng)心甙、蒽醌類化合物等成分[2]，其中黃酮類化合物占50%左右。 黃酮類化合物具有抗氧化、 抗腫瘤、清熱解毒、止瀉利尿、止咳平喘、防治心血管疾病以及抗菌消炎等保健功效[3-6]。 綠豆的保健功效主要來源于綠豆皮[7-8]。 綠豆皮作為綠豆淀粉和綠豆芽加工副產(chǎn)物，營養(yǎng)價(jià)值一直未得到重視，大多作為廢棄物用于生產(chǎn)飼料，造成資源的極大浪費(fèi)。

近年來， 國外有關(guān)綠豆皮的研究主要是提取物對(duì)人體機(jī)能的改善。 例如：Lee S 等[9]研究了綠豆皮提取物黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用。 國內(nèi)關(guān)于綠豆皮的研究主要在提取方面， 如朱文學(xué)等[10]研究了綠豆皮黃酮超聲輔助提取工藝。 大孔吸附樹脂是一種穩(wěn)定性好、 不溶于酸堿的有機(jī)高分子聚合物，具有選擇性好、吸附量大、吸附速度快、解吸容易、再生方便等特點(diǎn)[11-12]，適于黃酮類物質(zhì)的分離純化，然而，涉及綠豆皮黃酮提取物的吸附特性和純化方法研究較少， 未用高效液相色譜分析純化前、后綠豆皮黃酮。本文采用靜態(tài)吸附法研究NKA-9 大孔樹脂對(duì)綠豆皮黃酮提取液的吸附動(dòng)力學(xué)和吸附等溫線，并優(yōu)化NKA-9 純化綠豆皮黃酮的最佳工藝條件。 采用高效液相色譜分析純化前、后綠豆皮黃酮的成分變化，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行抗氧化分析。這些研究對(duì)科學(xué)利用綠豆皮資源，提高綠豆產(chǎn)品的附加值有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮： 采購于洛陽市新農(nóng)村蔬菜食品有限公司。 去除綠豆皮中的雜質(zhì)，于45 ℃恒溫干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定，粉碎過80 目篩；NKA-9、AB-8、D101 和DM301 大孔吸附樹脂： 購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

試驗(yàn)試劑：蘆?。–AS 號(hào)：153-18-4），上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）， 伊卡生物技術(shù)有限公司； 無水乙醇、醋酸、醋酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-1000Y 型高速粉碎機(jī)， 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；FA1004 型電子分析天平， 美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司；WD900B 型微波爐，順德市格蘭仕微波爐電器有限公司；UV2400 紫外-可見分光光度計(jì)， 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司； 湘儀TDZ5-WS 型離心機(jī)， 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；HL-2D 型恒流泵， 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；THZ-82 氣浴恒溫振蕩器，金壇市鴻科儀器廠；Re-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BSZ-100 型自動(dòng)收集器，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；Φ1.6×60 cm 玻璃層析柱，上海滬西分析儀器廠有限公司；Agilent 1260 型高效液相色譜儀， 美國安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理 根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]并作適當(dāng)修改，稱取一定量的4 種樹脂，用2 倍體積無水乙醇浸泡24 h 后，用蒸餾水洗至無醇味，然后用2倍體積的4% HCl 溶液浸泡5 h，用蒸餾水洗至中性； 再用2 倍體積的4% NaOH 溶液浸泡5 h，蒸餾水洗至中性后浸泡，備用。

1.3.2 樣液的制備 將16.00 g 綠豆皮粉末和320 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇混合均勻后，在功率為540 W 的條件下微波提取80 s，提取液4 800 r/min離心10 min， 在40 ℃下旋蒸至無醇味， 再加入4倍體積無水乙醇去除蛋白質(zhì)和多糖， 經(jīng)過濾、離心、濃縮之后定容至80 mL，備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣液中黃酮含量的測定

采用醋酸-醋酸鈉-三氯化鋁顯色法[10]，對(duì)樣品進(jìn)行全波長掃描， 確定最大吸收峰在270 nm，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品， 得到線性回歸方程為：y=25.405x+0.1285，其中x 為黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），y 為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.9963。

移液管取黃酮提取液0.4 mL 于10 mL 具塞刻度試管中，以醋酸-醋酸鈉-三氯化鋁顯色法，在270 nm 測吸光度并利用回歸方程，按下面公式計(jì)算得到綠豆皮黃酮提取液中總黃酮的含量。

式中：C——提取液黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V——提取液體積，mL；N——稀釋倍數(shù)；W——原料質(zhì)量，g。

1.3.4 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)[14]稱取NKA-9、AB-8、D101 和DM301 樹脂各1.00 g， 分別置于100 mL 具塞錐形瓶中， 加入30 mL 質(zhì)量濃度為0.46 mg/mL 的綠豆皮黃酮溶液，于恒溫振蕩器（25 ℃，120 r/min）振蕩吸附12 h，每隔一定時(shí)間吸取上清液測吸光度，計(jì)算吸附率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制大孔樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。 分別采用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)（5）和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（6）對(duì)吸附動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行擬合[15]。 篩選出吸附速率最快的樹脂。

式中：A——吸附率，%；D——解吸率，%；C0——吸附前黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C1——吸附后黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C2——解吸后黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1——樣品液體體積，mL；V2——解吸液體積，mL；m——大孔吸附樹脂的質(zhì)量，g；qe——單位質(zhì)量樹脂的平衡吸附量，mg/g；t——吸附時(shí)間，min；qt——t 時(shí)刻樹脂的吸附量，mg/g；K1—— 一級(jí)速率方程常數(shù)，g/（mg·min）；K2——準(zhǔn)二級(jí)速率方程常數(shù)，g/（mg·min）。

1.3.5 吸附等溫線模型稱取選定樹脂1.00 g，分別裝入100 mL 具塞錐形瓶中，加入不同濃度的綠豆皮黃酮粗提液30 mL，于不同溫度（25，35，45℃）振蕩（120 r/min）8 h，過濾，測定吸附飽和時(shí)溶液中黃酮的平衡吸附量， 得到不同溫度下的吸附等溫線， 并用吸附熱力學(xué)模型對(duì)其進(jìn)行線性擬合[16]。

吸附等溫方程可以定量說明恒溫狀態(tài)下，樹脂對(duì)不同起始濃度的黃酮化合物溶液的吸附情況[17]。 本文采用最常見的Langmuir 吸附等溫方程（7）和Freundlich 吸附等溫方程（8）對(duì)吸附等溫線進(jìn)行擬合，以描述其吸附機(jī)制[18-19]。

式中：Ce——溶液平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；Qe——平衡吸附量，mg/g；Qm——飽和吸附量，mg/g；KL——Langmuir 方程常數(shù)， 可以評(píng)價(jià)吸附量的大小，mL/mg；KF——Freundlich 方程常數(shù)，mL/mg；n——Freundlich 方程常數(shù)， 可以描述等溫線變化趨勢。

1.3.6 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

1.3.6.1 上樣流速和上樣體積的選擇 將預(yù)處理好的NKA-9 樹脂裝入1.6 cm×60 cm 的玻璃層析柱中，柱床體積（1 BV）為80 mL，將質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的黃酮提取液以1，2，3 BV/h 的流速勻速上柱，流出液每10 mL 收集一管，當(dāng)流出液黃酮的質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液黃酮質(zhì)量濃度的十分之一，認(rèn)為黃酮已達(dá)到泄漏點(diǎn)[20]，停止上樣，測定流出液黃酮的質(zhì)量濃度， 繪制出綠豆皮黃酮的泄漏曲線，找出泄漏點(diǎn)，得到最佳的上樣流速和上樣體積。

1.3.6.2 上樣液pH 的選擇 為考察上樣液pH 對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響，配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的綠豆皮黃酮提取液， 將綠豆皮黃酮提取液的pH 分別調(diào)至1，2，3，4，5，6，7 七個(gè)水平，以2 BV/h 的流速通過層析柱，收集流出液，測定吸光度，計(jì)算吸附率。

1.3.6.3 上樣黃酮質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附的影響采用濕法裝柱， 配制綠豆皮黃酮的質(zhì)量濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL，以2 BV/h 的流速上樣， 每10 mL 收集一管流出液， 測定黃酮含量，計(jì)算吸附率，根據(jù)泄露曲線得到最佳上樣液黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.7 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)

1.3.7.1 解吸液體積分?jǐn)?shù)的選擇 按照動(dòng)態(tài)的最佳吸附條件對(duì)已吸附好的樹脂進(jìn)行裝柱， 分別用體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，控制洗脫流速2 BV/h，收集流出液，測定吸光度，計(jì)算黃酮的解吸率，考察洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響。

1.3.7.2 洗脫液pH 的選擇 按照動(dòng)態(tài)的最佳吸附條件對(duì)已吸附好的樹脂進(jìn)行裝柱， 將70%乙醇的pH 分別調(diào)至1，2，3，4，5，6，7， 以2 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，收集流出液，測定吸光度，計(jì)算解吸率，考察洗脫液pH 對(duì)洗脫效果的影響。

1.3.7.3 洗脫流速和洗脫體積的選擇 在動(dòng)態(tài)最佳吸附條件下，考察不同洗脫流速對(duì)NKA-9 大孔樹脂洗脫效果的影響。 將70%乙醇溶液的pH 調(diào)至3，分別以1，2，3，4，5 BV/h 的速度進(jìn)行洗脫，洗脫液分步收集，每10 mL 收集一管，測定每管中解吸液黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算相應(yīng)的解吸率。以流出液體積為橫坐標(biāo)， 流出液黃酮的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制在不同洗脫速率條件下的洗脫曲線，確定出最佳的洗脫流速和洗脫體積。

1.3.8 黃酮純度和回收率的測定 取綠豆皮黃酮粗提液和經(jīng)NKA-9 樹脂純化后的黃酮洗脫液，于50 ℃減壓濃縮至無醇味，真空冷凍干燥，得到粗黃酮和純化后黃酮的凍干粉， 按下式計(jì)算黃酮的純度和回收率。

式中：P——黃酮的純度，%；Q——黃酮的回收率，%；C1——純化前黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1——純化前黃酮總體積，mL；C2——純化后黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2——純化后黃酮總體積，mL；m——凍干后樣品質(zhì)量，mg。

1.3.9 純化前后綠豆皮黃酮液相色譜圖的對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的制備： 精密稱取牡荊素和異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，制得質(zhì)量濃度分別為210 μg/mL 和220 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液[21]。

供試液的制備：稱取16.00 g 綠豆皮粉末分為兩組，其中一組按照1.3.2 節(jié)的方法制備，另一組提取液按照大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸的最佳條件進(jìn)行綠豆皮黃酮的純化， 純化后的樣液經(jīng)減壓濃縮至20 mL 而成。

高效液相色譜法的工作條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18反相色譜柱； 流速：0.6 mL/min；檢測波長：268，335 nm； 柱溫：25 ℃； 進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：DVD 檢測器；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為1%磷酸鹽緩沖液； 梯度洗脫：0～15 min，25%A，75%B；15～20 min，100%A，0%B； 后運(yùn)行時(shí)間：5 min。

1.3.10 綠豆皮黃酮純化前后抗氧化活性研究

1.3.1 0.1 清除DPPH 自由基 根據(jù)參考文獻(xiàn)[22-23]作部分修改，即將不同質(zhì)量濃度的綠豆皮黃酮和VC 陽性對(duì)照溶液各2 mL 與2 mL DPPH （10-4mol/L，95%乙醇）溶液混勻后，避光反應(yīng)20 min，于波長517 nm 處測定吸光度Ai；2 mL 空白樣品（蒸餾水）與2 mL DPPH 溶液混勻，避光反應(yīng)20 min后測定吸光值為Ac，將2 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和VC 陽性對(duì)照溶液與2 mL 95%乙醇混勻后測定吸光度值為Aj， 按下式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

1.3.1 0.2 清除·OH 自由基 根據(jù)參考文獻(xiàn)[24]，采用水楊酸法對(duì)綠豆皮黃酮進(jìn)行·OH 自由基清除試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸附動(dòng)力學(xué)

2.1.1 吸附動(dòng)力學(xué)曲線 吸附過程的動(dòng)力學(xué)主要研究吸附過程的速率，吸附速率控制固-液界面上吸附質(zhì)的滯留時(shí)間[25]。在25 ℃條件下，分別測定了不同吸附時(shí)間NKA-9、AB-8、D101 和DM301 型樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附量， 畫出靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，如圖1，由圖1 可以看出，NKA-9、AB-8、D101 和DM301 型樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附均為快速平衡型， 在150 min 之前單位吸附量隨時(shí)間增加變化較大，之后基本保持不變，表明在試驗(yàn)條件下吸附達(dá)到平衡，其中，NKA-9、AB-8、D101 和DM301 型樹脂的平衡吸附量分別達(dá)到10.363，8.893，9.732，8.487 mg/g。

2.1.2 吸附動(dòng)力學(xué)模型 準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的擬合參數(shù)見表1，從表中可以看出，4 種樹脂的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的線性相關(guān)度要明顯高于準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)， 準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)所得平衡時(shí)樹脂的吸附量要顯著高于準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。 在4 種樹脂中，NKA-9 樹脂最終平衡吸附量與試驗(yàn)值較為接近， 說明準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)更適用于描述NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附過程。以t/qt對(duì)t作圖，見圖2，求得直線方程為準(zhǔn)二級(jí)速率方程，由表觀吸附速率常數(shù)K 可知，NKA-9 樹脂吸附速率要高于其他3 種樹脂， 這與圖1 的試驗(yàn)結(jié)果相吻合。 因此，選擇吸附速率較高的NKA-9 樹脂進(jìn)行以后的試驗(yàn)。

圖1 吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption kinetics curves

圖2 準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力曲線Fig.2 Pseudo-second adsorption kinetic curve

表1 動(dòng)力學(xué)模型的線性擬合回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear fitting regression equations and correlation coefficients of the dynamics models

2.2 吸附等溫線

不同溫度下NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮總黃酮的吸附等溫線如圖3 所示。從圖中可以看出，NKA-9樹脂的平衡吸附量隨綠豆皮黃酮濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL 時(shí)，吸附量增加緩慢。 同時(shí)，吸附量隨溫度的升高而降低，這是因?yàn)闃渲骄G豆皮黃酮的過程是自然放熱的過程，溫度較高時(shí)，黃酮的溶解性增加，不利于黃酮分子與樹脂表面活性位點(diǎn)的結(jié)合， 從而導(dǎo)致吸附力降低，因此選擇25 ℃進(jìn)行試驗(yàn)；此外，隨著綠豆皮總黃酮初始濃度的增加，吸附能力增強(qiáng)，但達(dá)到一定程度時(shí)增長變緩， 因而選取上樣質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。

采用Langmuir 吸附等溫方程和Freundlich 吸附等溫方程對(duì)吸附等溫線進(jìn)行擬合，分別以Ce對(duì)Ce/Qe和lnCe對(duì)lnQe作圖并進(jìn)行線性回歸，回歸方程和吸附相關(guān)參數(shù)見表2。

圖3 不同溫度下平衡吸附濃度和吸附量之間的關(guān)系Fig.3 The relationships between equilibrium adsorptionconcentrations and adsorption quantities at different temperature

由表2 可知，綠豆皮黃酮在NKA-9 樹脂上的吸附基本既符合Langmuir 和Freundlich 等溫吸附方程，從相關(guān)系數(shù)看，選用Langmuir 模型描述更佳。 在Langmuir 模型中，對(duì)于一定量的樹脂，隨著溫度的升高，飽和吸附量Qm下降，可能是因?yàn)闃渲骄G豆皮黃酮類物質(zhì)過程是自發(fā)性放熱的吸附過程且較高溫度會(huì)抑制黃酮分子與樹脂表面活性位點(diǎn)的結(jié)合[26]。 在Freundlich 模型中，特征常數(shù)n 均大于1，說明在研究范圍內(nèi)，NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附為優(yōu)惠吸附[27-28]，經(jīng)驗(yàn)常數(shù)KF隨溫度的升高而降低，說明吸附過程是放熱的過程，低溫有利于吸附。

表2 不同溫度下Langmuir 和Freundlich 吸附等溫線模型擬合回歸方程和吸附參數(shù)Table 2 Model fitting and adsorption data of Langmuir and Freundlich isotherm models

2.3 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸

2.3.1 上樣流速和上樣量對(duì)吸附效果的影響 如圖4 所示，NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮具有良好的動(dòng)態(tài)吸附性能。 提取液分別以1，2，3 BV/h 的速度上樣，其泄漏點(diǎn)分別在220（2.7 BV），170（2 BV），120 mL（1.5 BV）左右。 隨著上樣流速的增加，到達(dá)泄漏點(diǎn)時(shí)的上樣量逐漸減小。 其中， 當(dāng)流速在1 BV/h 時(shí)，最遲出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，流速在3 BV/h 時(shí)，泄漏點(diǎn)最早，這是因?yàn)樯现俣冗^快，使綠豆皮黃酮與樹脂接觸時(shí)間較短，導(dǎo)致吸附率降低，上樣速度過慢，黃酮與樹脂充分接觸，同時(shí)也會(huì)延長試驗(yàn)的循環(huán)周期[29]。 綜合考慮，最佳上樣流速為2 BV/h，此時(shí)，上樣量為2 BV。

2.3.2 上樣液pH 的選擇 上樣液pH 會(huì)影響黃酮的電離程度，改變其存在的形式和溶解度，從而影響大孔樹脂對(duì)綠豆皮黃酮類化合物的吸附[30]。由圖5 可知，隨著上樣液pH 的升高，NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附先升高后降低。 當(dāng)pH 為3時(shí)，吸附率最大，達(dá)到84.45%，當(dāng)pH 大于3 時(shí)，黃酮的吸附率呈下降趨勢。 這可能是因?yàn)榇蟛糠贮S酮類化合物為多羥基酚類化合物，呈弱酸性，溶質(zhì)在酸性條件下溶解度降低，有利于樹脂的吸附[31]；在堿性條件下，黃酮化合物以分子形式存在，不易與樹脂發(fā)生吸附作用，此外，pH 值較小時(shí)，黃酮類物質(zhì)的糖苷鍵水解也會(huì)影響樹脂的吸附性。因此，選擇上樣液的pH 為3。

2.3.3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附的影響 由圖6 可知，上樣質(zhì)量濃度在0.4 mg/mL 最遲出現(xiàn)泄漏點(diǎn)（2 BV），質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL 泄漏點(diǎn)提前。通過計(jì)算吸附率，如圖7，隨著質(zhì)量濃度的增加，NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附率也隨之增加，當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL 時(shí)，吸附率最大，達(dá)到89.22%，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL 時(shí)，吸附率逐漸下降。原因可能是隨著上樣質(zhì)量濃度增加，導(dǎo)致泄漏點(diǎn)提前， 使黃酮物質(zhì)在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散能力降低， 造成吸附率下降， 當(dāng)上樣質(zhì)量濃度過高，所含雜質(zhì)過多，雜質(zhì)會(huì)與黃酮競爭吸附活性位點(diǎn)[32-33]，也會(huì)造成層析柱濾膜的堵塞，從而影響吸附效果；當(dāng)上樣液的質(zhì)量濃度較低時(shí)，吸附動(dòng)力減少，降低吸附率。 因此，選擇上樣的質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL， 這與之前做的吸附等溫線結(jié)果相一致。

圖4 不同流速的吸附泄漏曲線Fig.4 Breakthrough curve at different flow rates

圖5 上樣液pH 值對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of different pH values of sample solution on adsorption

圖6 不同黃酮質(zhì)量濃度的吸附泄漏曲線Fig.6 Breakthrough curve at different sample concentration

圖7 上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響Fig.7 Effect of sample concentration on adsorption rate of NKA-9 macroporous resin

2.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響 由圖8 可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫液對(duì)樹脂中黃酮的解吸率逐漸增加， 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，解吸率達(dá)到86.08%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，解吸率逐漸下降。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)不同，極性大小也不同，黃酮和大孔吸附樹脂之間存在一定的范德華力， 兩物質(zhì)的極性越相似則范德華力越大[34]。 乙醇的體積分?jǐn)?shù)越大，極性越小，樹脂中大量的醇溶性雜質(zhì)就會(huì)越多，從而使綠豆皮黃酮的純度下降， 而70%的乙醇可能與綠豆皮黃酮的極性相似，洗脫效果較好。 因此，選擇70%的乙醇進(jìn)行洗脫。

2.3.5 解吸液pH 對(duì)解吸效果的影響 由圖9 可知， 綠豆皮黃酮的解吸率隨pH 的增加先上升后下降。當(dāng)pH 值為5 時(shí)，解吸率最高，達(dá)到84.61%，當(dāng)pH 值大于5 時(shí)， 綠豆皮黃酮的解吸率下降趨勢逐漸加強(qiáng)。 這可能是因?yàn)榫G豆皮黃酮提取液呈弱酸性，弱酸性的條件有利于NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的解吸。 因此，選擇洗脫劑的pH 值為5。

2.3.6 洗脫劑體積和洗脫流速對(duì)解吸效果的影響洗脫速率是影響樹脂吸附分離特性的一個(gè)重要因素。由圖10 可以看出，隨著洗脫劑體積的增加，洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度逐漸升高， 當(dāng)?shù)竭_(dá)一定洗脫體積之后， 洗脫得到的黃酮質(zhì)量濃度逐漸下降，直到黃酮的質(zhì)量濃度幾乎不變，說明黃酮基本洗脫完全。 另外，隨著洗脫液流速加快，洗脫帶變窄，拖尾現(xiàn)象不明顯，洗脫效果較好，洗脫液體積相對(duì)減少；流速過慢，洗脫時(shí)間增加，洗脫液的體積也相應(yīng)地增加。 由圖11 可知，隨著洗脫流速的增加， 黃酮的解吸率逐漸增加， 當(dāng)洗脫流速為2 BV/h 時(shí)，解吸率最高，達(dá)到91.26%，當(dāng)流速繼續(xù)增加， 解吸率逐漸下降。 因此， 選擇洗脫流速為2 BV/h，此時(shí)，洗脫體積為180 mL（2.3 BV），洗脫效果最好。

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on adsorption quantity of flavonoids from mung bean hull

圖10 不同洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響Fig.10 Elution profiles of flavonoids on NKA-9 resin at different flow rates of aqueous ethanol

圖11 洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響Fig.11 Effect of elution rate on desorption efficiency

2.4 綠豆皮總黃酮的純化效果

2.4.1 綠豆皮黃酮純化前后黃酮純度及回收率的比較 以NKA-9 樹脂純化綠豆皮黃酮的最佳工藝參數(shù)：上樣液總黃酮質(zhì)量濃度0.4 mg/mL、上樣流速2 BV/h、上樣液體積2 BV，上樣液pH 3，洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)70%，洗脫流速2 BV/h，洗脫液體積2.3 BV，洗脫液pH 5，純化綠豆皮黃酮提取液，結(jié)果如表3。

2.4.2 綠豆皮黃酮純化前后高效液相色譜圖 圖12 是標(biāo)品的色譜圖， 保留時(shí)間為13.963 min 和14.618 min 的分別是牡荊素和異牡荊素。 純化前后的樣液與標(biāo)品對(duì)比， 說明綠豆皮黃酮提取液中主要的黃酮物質(zhì)是牡荊素和異牡荊素。由圖13 可知，等量的綠豆皮黃酮純化前圖譜在8～18 min 時(shí)響應(yīng)值偏離零線較高， 可能是因?yàn)榫G豆皮黃酮粗提液雜質(zhì)存在引起的， 而純化后的綠豆皮黃酮雜峰1 和2 顯著減少，在8～18 min 響應(yīng)值偏離零線較低，而且，純化前后綠豆皮中牡荊素和異牡荊素的峰高無明顯差異，說明經(jīng)過NKA-9 樹脂純化后得到的成分純度明顯提高； 出現(xiàn)的峰1 的紫外光譜在310 nm 處有吸收，峰2 在230，280 和310 nm處有吸收，初步判斷為鞣質(zhì)或生物堿類物質(zhì)。

2.5 綠豆皮總黃酮的抗氧化活性

2.5.1 清除DPPH 自由基 從圖14 可知，隨著綠豆皮黃酮和VC 質(zhì)量濃度的增加，DPPH 自由基清除率逐漸上升。在質(zhì)量濃度較低時(shí)，綠豆皮黃酮和VC 對(duì)DPPH 自由基清除作用顯著，隨著質(zhì)量濃度增加， 清除率趨于平緩。 純化后綠豆皮黃酮的DPPH 自由基清除率低于同一質(zhì)量濃度的VC 溶液， 當(dāng)質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL 時(shí)，VC 和純化后綠豆皮黃酮DPPH 自由基清除率分別達(dá)到78.78%、65.64%。結(jié)果表明，純化后的綠豆皮黃酮具有一定清除DPPH 自由基的能力。

表3 NKA-9 樹脂純化綠豆皮黃酮的純度和回收率Table 3 Recovery rate and purity of flavonoids from mung bean hull after purification with NKA-9

圖12 標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLCFig.12 HPLC chromatogram of standard samples

2.5.2 清除·OH 自由基 從圖15 可知，綠豆皮黃酮和VC 對(duì)·OH 自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在同一質(zhì)量濃度下，綠豆皮黃酮的清除能力低于VC， 當(dāng)質(zhì)量濃度從0.025 mg/mL 上升到0.4 mg/mL 時(shí)，VC 的清除率從49.85%上升到97.61%，綠豆皮黃酮清除率從43.43%上升到89.55%。這說明純化后的綠豆皮黃酮具有較好的·OH 自由基清除力。

圖13 綠豆皮黃酮提取液純化前后HPLC 圖Fig.13 The HPLC chromatogram of extract before and after purification of flavonoids from mung bean hull

圖14 綠豆皮黃酮DPPH 自由基清除效果Fig.14 DPPH radical scavenging effect of flavonoids extracted from phaseolus radiatus hull

圖15 綠豆皮黃酮羥自由基清除效果Fig.15 Hydroxyl radical scavenging effect of flavonoids extracted from phaseolus radiatus hull

3 結(jié)論

NKA-9 樹脂吸附綠豆皮黃酮的吸附動(dòng)力學(xué)可用Pseudo-second-order 模型較好地?cái)M合（R2＞0.99），其中，表觀吸附速率常數(shù)為K=3.205×10-3g/（mg·min）。 Langmuir 吸附等溫線能更好地描述NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的吸附過程（R2＞0.99），根據(jù)計(jì)算結(jié)果得到該吸附過程是自然的放熱的物理吸附過程。

NKA-9 樹脂純化綠豆皮黃酮物質(zhì)的最佳動(dòng)態(tài)吸附和解吸條件為：2 BV 質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的綠豆皮黃酮提取物（pH 3）為上樣液，上樣流速2 BV/h，用2.3 BV 70%的乙醇溶液（pH 5）以2 BV/h流速洗脫，在此條件下，綠豆皮黃酮的純度提高2.7 倍，黃酮的回收率提高2.4 倍。

高效液相色譜分析得到的綠豆皮黃酮類化合物主要為牡荊素和異牡荊素， 初步證實(shí)了其為綠豆抗氧化的主要成分， 經(jīng)NKA-9 樹脂純化后，純度顯著提高，證實(shí)NKA-9 樹脂對(duì)綠豆皮黃酮純化的可行性。

對(duì)綠豆皮黃酮的抗氧化研究表明，經(jīng)NKA-9大孔吸附樹脂純化后， 綠豆皮黃酮有較強(qiáng)的DPPH·、·OH 自由基清除能力。說明綠豆皮黃酮為潛在的抗氧化劑來源， 為后續(xù)細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)提供一定理論基礎(chǔ)。