徐菲菲 陳茂深 常冰玉 郭尚偉 楊 藝 麻建國 鐘 芳

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫214122 2 東阿阿膠股份有限公司 國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心 山東聊城252201）

阿膠是驢皮經(jīng)前處理、煎煮化皮、濃縮熬煮等多道工序而制成的固體膠，是我國傳統(tǒng)名貴中藥。其主要成分為蛋白質(zhì)類，含量占60%～85%[1]，其中的蛋白質(zhì)、 多肽和氨基酸是加工過程中驢皮膠原纖維逐漸水解而形成的一系列降解產(chǎn)物[2]。

目前對阿膠的研究主要集中在阿膠的真?zhèn)舞b別和優(yōu)劣評價[3]等方面，而阿膠工藝對阿膠品質(zhì)的影響研究很少。煎煮化皮、濃縮熬煮等加工工藝是除驢皮、水質(zhì)[4]等用料講究外阿膠的又一獨特之處，對阿膠的品質(zhì)影響很大。目前阿膠獨特的加工工藝中，驢皮蛋白質(zhì)發(fā)生何種變化、各工藝及其參數(shù)對產(chǎn)物性質(zhì)的影響尚不十分明確。有關(guān)魚皮、牛皮或其它富含膠原的組織中提取明膠蛋白及蛋白特性的研究很多，如Mehraj Ahmad 等[5]對單角革鲀皮分別用0.2 mol/L 醋酸和磷酸前處理，然后在中性條件下45 ℃熱水浸提4～8 h， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)出膠率為5.23%～11.54%，α1 和α2 鏈?zhǔn)翘崛∥镏械闹饕煞郑寻l(fā)生一定程度的降解。 L.S. Senaratne 等[6]用0.5 mol/L 醋酸浸泡3 d，胃蛋白酶水解48 h 提取暗鰭兔頭鲀皮中的蛋白并研究提取物的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)出膠率達(dá)54%，暗鰭兔頭鲀皮膠原蛋白的變性溫度為28 ℃，比豬皮低9 ℃。 這些工藝與阿膠的加工工藝相差甚遠(yuǎn)，無法預(yù)知驢皮在單純熱和水的作用下提取出蛋白的性質(zhì)以及對提取物進(jìn)行熬煮濃縮后所發(fā)生的性質(zhì)變化。

本文通過對前處理后的驢皮進(jìn)行煎煮化皮，分析驢皮出膠率、提取物的氨基酸組成和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布，研究濃縮熬煮時間對產(chǎn)物的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布、顏色和流變學(xué)特性的影響，從而研究化皮和濃縮過程中蛋白質(zhì)特性的變化，為阿膠加工工藝的改進(jìn)和阿膠品質(zhì)的提升提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢皮由東阿阿膠股份有限公司提供。

牛血清白蛋白：創(chuàng)賽科技有限公司；鹽酸、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜儀Agilent 1260，美國安捷倫公司； 多角度激光散射凝膠色譜儀DAWN HELEOS Ⅱ，美國懷雅特技術(shù)公司；高精度分光測色儀Ultra Scan Pro 1166，美國Hunterlab 公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；流變儀Discovery DHR-2，美國TA 儀器公司。

1.2 自制阿膠加工工藝

清洗： 將干驢皮用清水沖洗至水中無砂土，清水浸泡2d，每半天換水一次。 待皮泡軟后用刀片將驢毛及附肉除去，清洗切割為10 cm×10 cm 方塊。

掇皮：將切割為方塊的驢皮置于2%碳酸鈉溶液加熱煮沸，至驢皮打卷時撈出，去除脂肪和上皮層角質(zhì)；再將驢皮于90 ℃熱水中清洗，去除熱溶性油脂。

化皮：清水清洗后，加4 倍水（相對于干驢皮）于高壓蒸汽滅菌器中一定溫度和一定時間加壓化皮。 分別在105，110，115，120，125 ℃下化皮1.0 h，取膠液，過200 目篩。殘余皮料加4 倍水（相對于干驢皮），重復(fù)化皮。 合并兩次化皮得到的膠液，離心（4 500 r/min，10 min）， 取澄清液。 另取驢皮在115℃條件下分別化皮0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，重復(fù)化皮后取澄清液。

濃縮：將化皮過濾后的澄清膠液，置于平底鍋中，電磁爐文火熬煮并不斷攪拌（100 r/min），熬煮一定時間后取樣。 所得樣品均冷凍干燥后保存[7]。

1.3 出膠率的測定

出膠率的計算公式

式中，ω——出膠率；m1——化皮后殘渣的干基質(zhì)量，g；m0——干驢皮的質(zhì)量，g；ω0——干驢皮的水分含量，%。

按上述公式計算在不同化皮壓力、不同化皮時間下驢皮的出膠率。

1.4 氨基酸組成分析

精密稱取樣品于水解管中， 加入8 mL 鹽酸溶液（6 mol/L），將水解管抽真空密封，于120 ℃烘箱中水解21 h。 取出后冷卻，加入氫氧化鈉溶液中和酸液后定容至25 mL，雙層濾紙過濾。混勻，12 000 r/min 離心10 min，將上清液移至液相小瓶中待測。

采用OPA-PMOC 柱前衍生化分析方法。 色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A 相，20 mmol/L 醋酸鈉溶液；B 相，20 mmol/L醋酸鈉、甲醇、乙腈（體積比為1 ∶2 ∶2）；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外檢測器338，262 nm（Pro 和Hyp）；梯度洗脫[8]。

1.5 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分析

試驗條件：采用多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布。流動相：含0.15 mol/L氯化鈉的0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH 7.0）（含2‰疊氮化鈉）；流速：0.35 mL/min，紫外檢測器220 nm。 用牛血清白蛋白（Mw=77 ku）校準(zhǔn)儀器[9]。

稱取適量凍干樣品溶解于流動相， 配制成1 mg/mL 的樣品溶液， 過0.45 μm 微孔濾膜后進(jìn)行HPSEC-RI-MALLS 分析。采用ASTRA 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 dn/dc 值取0.180[10]。

1.6 顏色分析

阿膠溶液色度值的測定：配制5%的阿膠水溶液，4 000 r/min 離心5 min，取上清液于色差計的樣品皿中，記錄L*、a*、b*值，重復(fù)測定3 次。

1.7 流變學(xué)特性分析

取適量阿膠粉末于熱水中充分溶解， 配制成10%的阿膠水溶液。 采用Flow Ramp 模式測定阿膠溶液表觀黏度隨剪切速率變化的曲線。 測定條件：溫度25 ℃，40 mm 平板，剪切速率為10～300 s-1，對數(shù)取點。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化皮條件下驢皮的出膠率

化皮是在一定的溫度（壓力）和時間下對經(jīng)過前處理的驢皮提取膠原蛋白的過程，化皮的溶解物與化皮前物質(zhì)的質(zhì)量比即為出膠率。出膠率是阿膠生產(chǎn)廠家最為關(guān)心的產(chǎn)量和質(zhì)量的權(quán)衡問題。

化皮時間為1.0 h 時，不同化皮溫度（105，110，115，120，125 ℃）條件下的出膠率如圖1 所示。 可以發(fā)現(xiàn)，在105～120 ℃范圍內(nèi)，隨著化皮溫度的增加，出膠率逐漸增大至78%左右，溫度繼續(xù)增加，出膠率也會有一定程度的增大。這表明隨著化皮溫度逐漸增加， 驢皮中膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)坍塌瓦解，膠原蛋白逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性明膠[11-12]，體系中主要是蛋白質(zhì)的提取過程；但溫度繼續(xù)升高，又會有少量的蛋白質(zhì)溶出。

化皮溫度為105 ℃時，不同化皮時間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h）下的出膠率如圖2 所示。 結(jié)果表明，隨著化皮時間的增加，出膠率逐漸增大至78%左右后趨于穩(wěn)定，當(dāng)化皮時間達(dá)1.0 h，出膠率即可達(dá)到最大值，表明化皮時間為0.5～1.0 h，體系中主要是蛋白質(zhì)的提取過程[13]。 但時間超過1.0 h，提取蛋白質(zhì)的作用不再明顯。 這表明，在105～115 ℃化皮溫度范圍內(nèi)和0.5～1.0 h 化皮時間范圍內(nèi)， 化皮溫度和化皮時間的增加會使出膠率升高，但超過這一臨界點，出膠率不再增加或增加不明顯。

圖1 不同化皮溫度下的出膠率Fig.1 The yield at different extraction temperature

圖2 不同化皮時間下的出膠率Fig.2 The yield at different extraction time

2.2 不同化皮條件對驢皮提取物氨基酸組成的影響研究

化皮條件的不同會影響出膠率的高低， 但提取出的物質(zhì)是否為非膠原類的雜蛋白或其它種類的物質(zhì)尚未有報道。

不同化皮條件處理驢皮得到的水解物氨基酸組成如表1 所示， 結(jié)果以每種氨基酸占總氨基酸的含量百分比表示。 結(jié)果顯示，不同化皮溫度和化皮時間生產(chǎn)的阿膠，其氨基酸組成非常接近，這表明， 不同化皮條件下提取出的蛋白質(zhì)種類沒有明顯差別。 此外，在化皮溫度增加至125 ℃時，出膠率顯著增加，并非有雜蛋白溶出。

表1 不同化皮溫度和時間下水解物的氨基酸組成（%）Table 1 Amino acid composition of hydrolysates at different extraction temperature and time （%）

2.3 不同化皮和濃縮條件對驢皮提取物蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的影響

化皮是在較高溫度（壓力）下提取驢皮中的膠原蛋白，不同的提取溫度（即壓力）和提取時間可能會影響提取物的分子質(zhì)量[14]。

對驢皮在不同溫度下化皮相同的時間（1.0 h）后，分析其提取物的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖3所示。 不同的溫度下提取物命名為P105、P110、P115、P120、P125。 將分布曲線按峰形和分子質(zhì)量大小分為三部分， 分別為HMW 區(qū) （分子質(zhì)量＞1 500 ku）、MMW 區(qū)（分子質(zhì)量為30～1 500 ku）、LMW 區(qū)（分子質(zhì)量＜30 ku）， 用ASTRA 軟件計算出各區(qū)域的重均分子質(zhì)量和所占比例，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，隨著化皮溫度的增加，提取出的蛋白質(zhì)中，HMW 區(qū)的重均分子質(zhì)量逐漸增大（1 591～3 025 ku）。造成這種現(xiàn)象的原因可能是化皮溫度較低時， 驢皮中較短鏈的蛋白質(zhì)先溶于水中，因此體系中的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)較多；而化皮溫度較高時， 可以使較難溶解的較長鏈蛋白質(zhì)溶于水，體系中的高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)較多，有文獻(xiàn)報道[15]較高壓力下蛋白質(zhì)的聚集現(xiàn)象會抑制驢皮中的膠原纖維蛋白質(zhì)的降解作用， 故驢皮中高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)不需經(jīng)降解為短鏈而提取出來。 因此較低溫度下提取驢皮中的膠原蛋白， 更易提取出短鏈蛋白質(zhì)。 化皮溫度由110 ℃增大至125 ℃，LMW 區(qū)的占比由10.31%增大至22.61%， 在這一溫度段內(nèi)， 化皮溫度的增大同時會導(dǎo)致已經(jīng)提取出的HMW 和MMW 區(qū)的較大分子蛋白降解為較小分子的蛋白質(zhì)。

圖3 不同化皮溫度下提取物的分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular weight distribution of extracts with different extraction temperature

表2 不同化皮溫度下提取物的各區(qū)域分子質(zhì)量及所占比例Table 2 Molecular weight and the proportion in each region of extracts at different extraction temperature

對驢皮在相同溫度（115 ℃）下化皮不同的時間后，分析其提取物的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖4所示。 不同時間的提取物命名為T0.5、T1.0、T1.5、T2.0、T2.5。 將分布曲線按峰形分為三部分，分別為HMW區(qū) （分子質(zhì)量＞1 500 ku）、MMW 區(qū) （分子質(zhì)量為30～1 500 ku）、LMW 區(qū)（分子質(zhì)量＜30 ku），用ASTRA 軟件計算出各區(qū)域的重均分子質(zhì)量和所占比例，如表3 所示。

結(jié)果顯示，化皮時間較短時（0.5 h），HMW 區(qū)域的蛋白質(zhì)占比僅為0.21%，較其余樣品小，可能是由于較短時間化皮時， 體系中主要發(fā)生的是膠原蛋白的提取過程， 分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)先溶解于水中，體系中低分子蛋白質(zhì)含量多[5]。

在一定的化皮溫度（115 ℃）和化皮時間（1.0 h）下，對驢皮提取物進(jìn)行濃縮熬煮，在不同的濃縮時間下的產(chǎn)物分別命名為N0、N4、N8、N12、N16、N20。其分子質(zhì)量分布曲線如圖5 所示。由ASTRA 軟件計算出HMW 區(qū)、MMW 區(qū)和LMW 區(qū)的重均分子質(zhì)量和占比，結(jié)果如表4 所示。

由圖5 可以得出，隨著濃縮的時間逐漸延長，高分子蛋白質(zhì)峰逐漸減小直至消失， 峰形逐漸右移。 由表可知，HMW 區(qū)的蛋白含量逐漸減少（由25.24%減少至1.91%），MMW 區(qū)域的蛋白質(zhì)含量逐漸增加（由70.22%增加至95.45%），Mw 逐漸減?。ㄓ?1 ku 降至38 ku），這表明濃縮工藝是蛋白質(zhì)降解的重要階段， 可以使高分子蛋白質(zhì)降解，Mw 減小。 同時，即使在化皮時產(chǎn)生了較多的高分子蛋白質(zhì)，也可以經(jīng)濃縮工藝得到充分降解，決定阿膠蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分散程度的關(guān)鍵因素是濃縮時間。 濃縮工藝主要的作用是使MMW 區(qū)的蛋白質(zhì)Mw 減小， 同時使提取出的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布更集中。

圖4 不同化皮時間下提取物的分子質(zhì)量分布Fig.4 Molecular weight distribution of extracts at different extraction time

圖5 不同濃縮時間下產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Fig.5 Molecular weight distribution of products at different concentration time

表3 不同化皮時間下提取物的各區(qū)域分子質(zhì)量及所占比例Table 3 Molecular weight and the proportion in each region of extracts at different extraction time

表4 不同濃縮時間下產(chǎn)物的各區(qū)域分子質(zhì)量及所占比例Table 4 Molecular weight and the proportion in each region of products with different concentration time

2.4 不同化皮和濃縮條件對驢皮提取物顏色的影響

大量的研究表明， 提取條件的不同會導(dǎo)致明膠的顏色差異，從而決定了其品質(zhì)和應(yīng)用方向。 對于驢皮膠原蛋白降解產(chǎn)物， 其顏色可能也會受到加工工藝的影響，進(jìn)而影響阿膠的品質(zhì)。

對驢皮進(jìn)行前處理后， 經(jīng)不同化皮條件和濃縮時間處理后制得的阿膠半成品膠液， 對膠液進(jìn)行顏色分析，結(jié)果如表5 和表6 所示。經(jīng)不同化皮條件處理后再濃縮熬煮而成的膠液命名為PN105、PN110、PN115、PN120、PN125、PN105、TN0.5、TN1.0、TN1.5、TN2.5。結(jié)果表明，經(jīng)不同化皮溫度處理的產(chǎn)物，其L*、a*、b*值均無顯著性差異， 表明化皮工藝中溫度的改變對顏色影響很??；而隨著化皮時間的延長，膠液的b*值顯著增加，顏色逐漸變黃。

隨著濃縮時間的延長，L*值、b*均顯著增長，即膠液的亮度逐漸增大，膠液越來越透亮，這與膠越熬越透亮的經(jīng)驗之談相吻合。 而黃值增加的原因尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

表5 不同化皮條件下膠液的顏色Table 5 Color values of solutions at different extraction temperature and time

表6 不同濃縮時間下膠液的顏色Table 6 Color of solutions at different concentration time

2.5 不同化皮和濃縮條件對驢皮提取物流變學(xué)特性的影響

通過對不同化皮和濃縮條件制得的阿膠膠液進(jìn)行流變學(xué)特性分析，其非牛頓指數(shù)和黏度（剪切速率為20 s-1）如表7 所示。

可以發(fā)現(xiàn)， 不同化皮溫度和時間對膠液的黏度和非牛頓指數(shù)影響不大； 不同化皮時間制得的膠液，其黏度和非牛頓也無明顯差異，因此化皮條件的不同不會明顯改變流變學(xué)特性。

不同濃縮時間對膠液的非牛頓指數(shù)n 和黏度（剪切速率為20 s-1）結(jié)果如表8 所示。 由表可以看出，在0～8 h 范圍內(nèi)，隨著濃縮時間的延長，膠液的黏度大幅減小，n 值也逐漸接近于1?？梢姡?～8 h 的濃縮時間對膠液的流變學(xué)特性影響最大。 但當(dāng)濃縮時間延長至8～20 h， 其黏度和非牛頓指數(shù)無明顯差異。

3 結(jié)論

本文通過研究驢皮在不同的化皮和濃縮條件下產(chǎn)物的蛋白質(zhì)特性， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)出膠率隨化皮溫度和時間的增加而增大， 但增大到115 ℃和1.0 h，出膠率無明顯增大或增大幅度很小。 氨基酸組成分析結(jié)果表明在105～125 ℃的化皮溫度和0.5～2.5 h 的化皮時間范圍內(nèi)，并未提取出種類不同的蛋白質(zhì)。 化皮溫度和時間對提取物的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布有一定的影響， 較高的化皮溫度會導(dǎo)致驢皮中的高分子蛋白質(zhì)不需經(jīng)降解為短鏈就被提取出來， 同時會對已經(jīng)提取出的較大分子蛋白有一定的降解作用。 較短的化皮時間（0.5 h）較先提取出低分子蛋白。 濃縮時間對提取物有較大程度的降解作用，濃縮時間逐漸延長，可以使得體系中的分子質(zhì)量分布更加集中。 化皮溫度和時間的不同對膠液的顏色和流變學(xué)特性幾乎無影響， 而濃縮時間增大會使得膠液亮度顯著增大， 黏度明顯下降。

表7 不同化皮溫度和時間下膠液的流變學(xué)特性Table 7 Rheological properties of solutions at different temperature and time

表8 不同濃縮時間下膠液的流變學(xué)特性Table 8 Rheological properties of solutions with different concentration time