王琳琳 王 剛* 張 灝 趙建新 陳 衛(wèi)，2

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫214122 2 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無錫214122）

便秘 （constipation）是臨床常見的多種疾病的一個(gè)癥狀，主要是指排便次數(shù)減少、頻率低，在不使用瀉劑的情況下， 每3～4 d 或更長(zhǎng)的時(shí)間排便1 次，每周排便次數(shù)少于3 次，糞便量減少、糞便干結(jié)、排便費(fèi)力、排便不盡，排便同時(shí)并伴有腹痛、腹脹等[1-2]。 便秘在人群中的患病率高達(dá)27%，然而只有一小部分便秘者會(huì)就診。 便秘可以影響各年齡段的人。女性多于男性，老年多于青、壯年，而且隨著年齡的增加，便秘也會(huì)逐漸加重[3-4]。其治療的原則就是消除病因，改善癥狀，恢復(fù)正常腸動(dòng)力和正常排便的生理功能， 因此是一個(gè)個(gè)體化的綜合治療過程[5]。目前用于治療便秘的主要臨床藥物包括容積性瀉劑、瀉鹽、滲透性瀉劑、刺激性瀉劑、潤(rùn)滑性瀉劑等藥物，這些藥物或多或少都存在著價(jià)格昂貴，毒副作用大，易產(chǎn)生藥物依賴，而且并不是對(duì)所有的患者都有效等問題。 長(zhǎng)期使用刺激性瀉藥容易引起“瀉劑結(jié)腸”，使得治療便秘難度加大。臨床研究表明：便秘患者腸道內(nèi)存在嚴(yán)重的菌群失調(diào)， 通過給予益生菌對(duì)其局部的微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到治療便秘的目的，是目前該領(lǐng)域研究的新思路。

雙歧桿菌是人體腸道中一種重要的優(yōu)勢(shì)菌群，每克腸內(nèi)容物中約含108～1010個(gè)[6]，通過定植粘附在人的腸上皮細(xì)胞， 抵御外來病原菌及腸道有害菌的侵襲，起到占位性保護(hù)作用。 換言之，也就是起到生物屏障和生物拮抗作用。 這就要求其首先具有粘附于腸上皮細(xì)胞的特性。 本文假設(shè)具有粘附特性和不具備粘附特性的動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)便秘小鼠的腸肽類遞質(zhì)的分泌影響不同， 本文的研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)部分：1）所選兩株動(dòng)物雙歧桿菌（CCFM 624，CCFM 625）體外耐受胃腸液情況；2）所選兩株動(dòng)物雙歧桿菌 （CCFM 624，CCFM 625）體外粘附腸上皮細(xì)胞情況；3）所選兩株動(dòng)物雙歧桿菌（CCFM 624，CCFM 625）對(duì)便秘小鼠健康指標(biāo)和血清中胃腸調(diào)節(jié)肽分泌水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

BALB/c 雄性小鼠，7 周齡， 體重18～21 g，SPF 級(jí)，購(gòu)自江蘇蘇州蘇普斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)中心；鹽酸洛哌丁胺（2mg/膠囊）、酚酞（0.1 g，100 片）購(gòu)自無錫大藥房；胃腸調(diào)節(jié)肽：胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（Gas）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、P 物質(zhì)（SP）、內(nèi)皮素（ET-1）、生長(zhǎng)抑素（SS）和血管活性腸肽（VIP）試劑盒，購(gòu)自上海文樂生物科技有限公司；MRS 培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

SX-300 高壓滅菌鍋， 上海東亞壓力容器制造廠；5415R 離心機(jī) （Eppendorf），DG250 厭氧工作站， 英國(guó)DWS 公司；ZHJH-C1115B 型超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1）鹽酸洛哌丁胺混懸液 （1 mg/mL）的配制：鹽酸洛哌丁胺（2 mg/膠囊），取50 粒膠囊，將膠囊中的藥物粉末取出混勻， 加無菌水至100 mL，臨用前配制。

2）酚酞混懸液（7 mg/mL）的配制：酚酞片（0.1 g， 100 片），取7 片酚酞片用研缽研碎呈粉末后加水至100 mL，臨用前配制。

3）雙歧桿菌菌懸液的制備：將動(dòng)物雙歧桿菌CCFM625 發(fā)酵液于3 000 g 離心10 min， 用無菌的生理鹽水洗菌泥2 次， 再3 000 g 離心10 min以便于獲得純的菌體。 將此菌體以30%蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，保存于-20 ℃冰箱，經(jīng)凍藏試驗(yàn)驗(yàn)證，2 周內(nèi)所有菌株的數(shù)量均無明顯下降， 灌胃前將其用無菌生理鹽水配制成濃度為4×1010CFU/mL和4 ×108CFU/mL 的菌懸液用于動(dòng)物試驗(yàn)。

陽性對(duì)照植物乳桿菌ST-Ⅲ 菌懸液的配制方法與雙歧桿菌菌懸液的配制方法相同。

1.2.2 動(dòng)物雙歧桿菌耐受人工胃腸液情況研究人工胃腸液臨用前新鮮配制。 將胃蛋白酶溶于pH 3.0 的PBS 中，使其最終質(zhì)量濃度為3 g/L，經(jīng)濾膜（0.22 μm）過濾后得到模擬胃液。 同理，將胰蛋白酶溶于pH 8.0 的PBS 中使其最終質(zhì)量濃度為1 g/L，經(jīng)膜（0.22 μm）過濾后制成模擬腸液[7]。

將培養(yǎng)到穩(wěn)定期早期的動(dòng)物雙歧桿菌和植物乳桿菌用無菌生理鹽水重懸后，分別取1 mL 加入9 mL 人工胃液中，然后將此培養(yǎng)液放置于37 ℃厭氧工作戰(zhàn)中培養(yǎng)， 并分別在0，1，2 和3 h 取樣1 mL 加入9 mL 無菌生理鹽水中進(jìn)行10 倍稀釋，檢測(cè)活菌數(shù)。 在人工胃液中培養(yǎng)3 h 后，取1 mL 加入9 mL 模擬腸液中， 混勻后分別在37 ℃厭氧工作戰(zhàn)中培養(yǎng)2，4 和8 h，并于2，4 和8 h 分別取樣1 mL 加入9 mL 無菌生理鹽水中進(jìn)行10 倍稀釋，檢測(cè)活菌數(shù)。 動(dòng)物雙歧桿菌的存活率按照下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：N1——經(jīng)過模擬胃腸液處理之后的動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)，CFU/mL；N0——未處理前動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)， CFU/mL。

1.2.3 動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞HT-29 細(xì)胞的粘附能力研究 將HT-29 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胎牛血清和1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中， 于5%二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，每隔一天換一次培養(yǎng)液；待細(xì)胞傳代3～4 次并長(zhǎng)滿80%細(xì)胞培養(yǎng)板之后， 用胰酶消化，PBS 清洗后，離心，用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為105細(xì)胞/mL，將此濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于事先置入載玻片的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)至穩(wěn)定期早期的2 株動(dòng)物雙歧桿菌和一株植物乳桿菌用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液調(diào)整到濃度為107CFU/mL， 并與上述的HT-29 細(xì)胞共培養(yǎng)3 h，PBS 清洗4 次，然后用甲醇固定5～10 min，甲醇的添加量以鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)板為宜， 之后用姬姆薩染液進(jìn)行染色；用PBS 洗液沖洗染液至無色，常溫放置至自然干燥；取出載玻片，在100 倍的油鏡下觀察粘附強(qiáng)弱[8]，其中植物乳桿菌作為陽性對(duì)照。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì) BALB/c 雄性小鼠，7 周齡，體重18～21 g，SPF 級(jí)，飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境，喂食標(biāo)準(zhǔn)配方小鼠輻照飼料，自由飲食飲水，12 h 交替照明， 溫度控制在23℃±2℃，濕度為40%～60%。 動(dòng)物試驗(yàn)符合國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施辦法》要求， 且本試驗(yàn)的所有協(xié)議均有江南大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（JN. No20150326-0110-21）。

BALB/c 雄性小鼠適應(yīng)1 周后，對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)分組，共分成7 組，分別為空白組、模型組、酚酞陽性對(duì)照組、植物乳桿菌ST-Ⅲ陽性對(duì)照高、低劑量組和動(dòng)物雙歧桿菌CCFM 625 高、 低劑量組。 第1～14 天，空白組、模型組灌胃無菌生理鹽水 0.25 mL， 低劑量和高劑量組分別灌胃4×108、4×1010CFU/mL 的動(dòng)物雙歧桿菌 CCFM625 0.25 mL，植物乳桿菌ST-Ⅲ陽性對(duì)照低高劑量組同樣分別灌胃4×108、4×1010CFU/mL 的植物乳桿菌 ST-Ⅲ0.25 mL， 酚酞陽性對(duì)照組灌胃7 mg/mL 的酚酞0.25 mL，每天一次，連續(xù)灌胃14 d，試驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水。 第15 天開始造模，具體試驗(yàn)操作如下：除空白組灌胃無菌生理鹽水以外，其余組均灌胃鹽酸洛哌丁胺混懸液（1 mg/mL）0.25 mL，每天一次，連續(xù)灌胃3 天，第17 天晚上對(duì)小鼠進(jìn)行為期18 h 的禁食。 并于第2 天早上處死小鼠，取血清，檢測(cè)便秘相關(guān)胃腸肽遞質(zhì)的變化情況，試驗(yàn)具體分組及操作情況見表1。

1.2.5 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 室溫血液自然凝固10～20 min 后，2 000～3 000 r/min 離心20 min。 仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 血清中便秘相關(guān)胃腸調(diào)節(jié)肽（胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（Gas）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、P 物質(zhì)（SP）、內(nèi)皮素（ET-1）、生長(zhǎng)抑素（SS）和血管活性腸肽（VIP））水平檢測(cè)采用ELISA 試劑盒， 檢測(cè)方法按照說明書進(jìn)行。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)分組情況一覽表Table 1 Specific arrangements of animal experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用origin 8.5 和GraphPad prism 5 畫圖，所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 進(jìn)行顯著性分析，應(yīng)用one-way ANOVA 對(duì)不同組進(jìn)行比較， 所有數(shù)據(jù)均以±s 表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株體外耐受模擬胃腸液情況研究

所選的動(dòng)物雙歧桿菌在人工模擬胃腸液中表現(xiàn)出較好的耐受能力， 且所選各株菌在耐受人工胃腸液方面具有顯著性差異（P<0.05），具體情況見表2。 動(dòng)物雙歧桿菌CCFM625 對(duì)人工胃腸液的耐受能力接近90%，顯著大于陽性對(duì)照（ST-III），而動(dòng)物雙歧桿菌CCFM624 對(duì)人工胃腸液的耐受能力也達(dá)到了70%以上，由此可知：所選的兩株動(dòng)物雙歧桿菌均能較好的耐受人工胃腸液。 胃液在空腹和飽腹條件下，其pH 范圍在1～4 之間，食物停留在胃中的時(shí)間通常為20～30 min，胃液的低酸環(huán)境是大多數(shù)細(xì)菌通常無法耐受的， 然而這道屏障同時(shí)也會(huì)把有益菌拒之門外， 只有耐受胃酸的乳酸菌，才能通過人體的第一道屏障[9]。 通過胃液后，乳酸菌隨著食物一起來到十二指腸，在這里，膽汁開始分解脂肪， 而大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜恰恰是由脂肪組成的，因此，十二指腸也是大多數(shù)細(xì)菌的葬身之地，乳酸菌為了到達(dá)腸道，就必須要耐受十二指腸里的膽汁， 而只有耐受膽汁的乳酸菌才能繼續(xù)進(jìn)入腸道， 同時(shí)進(jìn)入腸道的乳酸菌必須具有粘附腸上皮細(xì)胞的能力， 才能在腸道中定植并發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[10]。

2.2 菌株體外粘附情況研究

通過對(duì)特定細(xì)胞系HT-29 的體外細(xì)胞粘附試驗(yàn)， 對(duì)上述2 株動(dòng)物雙歧桿菌菌株的粘附力的測(cè)定結(jié)果如表3。 可以看出，2 株動(dòng)物雙歧桿菌菌株與腸道上皮細(xì)胞的粘附能力不同，除CCFM625具有較強(qiáng)的粘附能力之外，CCFM624 不具備粘附的特性。CCFM625 粘附平均值在100 個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞以上，而CCFM624 粘附平均值在10 個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞以下。 這些結(jié)果表明雙歧桿菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的粘附性存在著菌株差異性。研究表明：雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附具有時(shí)間和濃度依賴性[11]，菌株差異性和種屬依賴性[12]，宿主特異性[13]和可逆性[14]。 粘附是定植的第一步，不能粘附于腸道上皮細(xì)胞表面的細(xì)菌，只能作為過路菌，而不能在腸道內(nèi)定植并進(jìn)一步增生。

表2 動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受能力Table 2 Tolerance of B. animalis strains in simulated gastric and small intestinal juices

表3 不同菌株對(duì)HT-29 細(xì)胞的粘附能力Table 3 Adhesion of different bacteria to HT-29 cells

2.3 小鼠健康指標(biāo)的變化情況

小鼠的健康指標(biāo)主要包括： 小鼠的體重、飲食、飲水情況。 由圖1、表4 和表5 可以看出：喂食不同濃度的同種不同株的雙歧桿菌以及植物乳桿菌后，小鼠的體重呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是各組間并不具有顯著性差異， 不同組間小鼠的飲食和飲水情況并沒有顯著差別，這些結(jié)果都與Ji Eun Kim[15]的報(bào)道相一致。

圖1 小鼠體重變化情況Fig.1 The changes in body weight of mice

2.4 小鼠血清便秘相關(guān)胃腸調(diào)節(jié)肽指標(biāo)的變化情況

經(jīng)不同的動(dòng)物雙歧桿菌喂養(yǎng)過后的小鼠血清中便秘相關(guān)的胃腸調(diào)節(jié)肽的變化情況見表6。由表可知： 不同劑量的同種不同株的雙歧桿菌對(duì)便秘小鼠血清中便秘相關(guān)指標(biāo)的影響不同， 其主要表現(xiàn)是：便秘后，小鼠血清中興奮性遞質(zhì)[16]（胃動(dòng)素、胃泌素、乙酰膽堿酯酶和P 物質(zhì)）呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，抑制性遞質(zhì)[16]（內(nèi)皮素、生長(zhǎng)抑素和血管活性腸肽）呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中模型組的興奮性遞質(zhì)指標(biāo)最低，抑制性遞質(zhì)指標(biāo)最高，而經(jīng)過動(dòng)物雙歧桿菌CCFM 625 和植物乳桿菌處理后的小鼠血清中興奮性遞質(zhì)指標(biāo)高于模型組， 而抑制性遞質(zhì)低于模型組。 不具備粘附特性的動(dòng)物雙歧桿菌CCFM 624 高劑量組處理過后的小鼠血清中興奮性遞質(zhì)與便秘組無顯著性差異， 低劑量組處理過后的小鼠血清中抑制性遞質(zhì)與便秘組無顯著性差

異。結(jié)果表明：具有粘附特性的動(dòng)物雙歧桿菌喂食小鼠后， 可以調(diào)節(jié)小鼠血清中便秘相關(guān)胃腸調(diào)節(jié)肽的分泌， 主要是促進(jìn)興奮性遞質(zhì)的分泌和降低抑制性遞質(zhì)的分泌，且具有濃度依賴性。這些結(jié)果與其它一些學(xué)者的報(bào)道相一致[17-19]。MTL 影響水和電解質(zhì)的運(yùn)輸，促進(jìn)胃的收縮和小腸節(jié)段性運(yùn)動(dòng)，加速腸道傳輸時(shí)間和增加結(jié)腸運(yùn)動(dòng)。 Gas 刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌， 促進(jìn)消化道黏膜上皮的生長(zhǎng)，對(duì)胃腸道平滑肌的收縮和幽門括約肌松弛，調(diào)節(jié)胃腸道收縮、 腸蠕動(dòng)和胃酸分泌。 因此，MTL，Gas 和SP 的血清水平的提升，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和內(nèi)容物的傳輸。ET 作為一種多功能多肽，在心血管、神經(jīng)內(nèi)分泌和胃腸功能等多方面發(fā)揮重要作用[20]。 同時(shí)，它在血管張力的穩(wěn)定和維持基本的心血管系統(tǒng)中起著重要的作用。 SS 抑制胃腸激素的釋放，如MTL、Gas 和胃酸的分泌、胰蛋白酶和淀粉酶。 Vecht[21]表明，SS 可以明顯減緩小腸通過時(shí)間，無論是否進(jìn)食的情況下。 VIP 是由28 個(gè)氨基酸組成的多肽， 其功能是放松胃腸道和胃腸道括約肌， 并顯著促進(jìn)致癌物質(zhì)對(duì)小鼠的致癌作用。Fasth 等[22]認(rèn)為VIP 是產(chǎn)生下行抑制的重要因素，導(dǎo)致腸道轉(zhuǎn)運(yùn)緩慢。

表4 小鼠飲水情況Table 4 The drinking water status of mice

表5 小鼠飲食情況Table 5 The dietary condition of mice

表6 動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響Table 6 Effects of B. animalis on serum parameters in a loperamide-induced constipation model in mice

3 結(jié)論

本文以具有較強(qiáng)粘附腸上皮細(xì)胞能力和耐受胃腸液的植物乳桿菌ST-Ⅲ作為對(duì)照菌株，檢測(cè)同種不同株的在粘附特性方面具有差異的動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)便秘小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的影響是否具有差異。研究結(jié)果表明：具有粘附特性的動(dòng)物雙歧桿菌可以顯著提高血清中便秘相關(guān)興奮性遞質(zhì)（MTL，Gas，AchE 和SP）的分泌，同時(shí)降低抑制性遞質(zhì)（SS，ET 和VIP）的分泌，且對(duì)便秘小鼠的健康指標(biāo)沒有顯著性影響， 表現(xiàn)出較好的調(diào)節(jié)便秘相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)的作用， 說明具有粘附特性的動(dòng)物雙歧桿菌緩解便秘主要是通過糾正血清中便秘相關(guān)胃腸調(diào)節(jié)肽水平分泌至正常來達(dá)到的。 但其對(duì)結(jié)腸以及整個(gè)腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和糞便含水量的影響情況是下一步研究的重點(diǎn)。