胡永亮，白學(xué)慧，陳玉芹，李守嶺，王應(yīng)清

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南 瑞麗 678600 )

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale為蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)中藥材中珍稀名貴品種之一。因其藥用價值極高，自然繁殖率低，市場需求量大，以及前期過度采挖等因素，野生鐵皮石斛已成為瀕危物種。目前，人工規(guī)?；N植是提供鐵皮石斛市場供給的主要途徑。云南作為鐵皮石斛的主要分布區(qū)和適生區(qū)，在瑞麗、芒市、盈江、龍陵、騰沖等21個縣市均有人工種植。2015年筆者在瑞麗市調(diào)查鐵皮石斛病害，發(fā)現(xiàn)一種鐵皮石斛葉斑病。該病害給種植農(nóng)戶帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，也阻礙了當(dāng)?shù)厥a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。筆者采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與rDNA-ITS測序鑒定相結(jié)合方法，主要對云南瑞麗市鐵皮石斛種植區(qū)的石斛葉斑病病原進行鑒定，并初步觀察研究該病原的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料來源 鐵皮石斛病株采集、病害調(diào)查和接種試驗均在云南省瑞麗市勐卯鎮(zhèn)鐵皮石斛種植基地進行。

1.2 病原菌分離純化 將鐵皮石斛葉片病健交界處組織剪成約0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊，依次經(jīng)75%乙醇和0.1%升汞消毒，再用無菌水洗滌3次后，置于PDA培養(yǎng)基中28 ℃避光培養(yǎng)120 h后，純化菌落并進行單孢分離獲得菌絲分離物。

1.3 分離物致病性測定

1.3.1 離體接種 使用針刺接種法，將純化的菌絲分離物接種到健康的鐵皮石斛葉片上，在28 ℃的人工培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)；對照組為無菌水處理，每處理20葉片。定期觀察石斛葉片發(fā)病情況，再對接種發(fā)病的石斛葉片進行病原菌分離。

1.3.2 田間接種 采用苗床噴霧接種，試驗組設(shè)3個重復(fù)，1個對照，每個重復(fù)面積為2 m2，共140株；將病原分離物配制成孢子懸浮液(105個/mL)，噴灑在田間健康生長的鐵皮石斛葉片上，保濕24 h以上。對照組為無菌水處理，處理10株。定期觀察發(fā)病情況并再次分離病株病原。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征，采用Olympus CX-31顯微鏡對病原菌的分生孢子、附著胞形態(tài)和大小進行觀察和測量，每個特征測量50個數(shù)據(jù)；采用易創(chuàng)YM130數(shù)字?jǐn)z像機進行顯微照片的拍攝。參照魏景超 等編寫的《真菌鑒定手冊》及陸家云編寫的《植物病原真菌學(xué)》[1-2]鑒定病原菌。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 提取rDNA采用CTAB法。隨機從形態(tài)學(xué)特征相同的4份菌株中選擇1株編號為SH-2的菌株，采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的真菌ITS5′-3和ITS4(5′-3′)通用引物進行PCR擴增[3-4]。

ITS1(5′-3′)：TCCGTAGGTGAACCTGCGC

ITS4(5′-3′)：TCCTCCGCTTATTGATATGC

反應(yīng)體系50 μL包含：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP (2.5 mM) 1 μL，Primer (10 μM) 各2 μL，Genomic DNA 100 ng，Ex Taq (5U/μL) 0.5 μL(Takara，RR001B)；ddH2O補至50 μL。

反應(yīng)條件包含：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性30 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測[5]。PCR擴增產(chǎn)物測序后與GenBank相關(guān)數(shù)據(jù)進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(DNAMAN)。

1.5 病原菌生物學(xué)特性測定

1.5.1 溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 將直徑為7 mm的菌塊接種到PDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)置分別為5，10，15，20，25，28，30，35 ℃ 等8個梯度處理)，培養(yǎng)至第5天時采用十字交叉法測量菌落直徑，第10天時在每個PDA平板中加入20 mL滅菌水后刮下分生孢子，制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每個處理重復(fù)4次。

1.5.2 pH值對病原菌菌絲生長和產(chǎn)飽的影響 將直徑為7 mm的菌塊分別接種到不同pH值(pH=3，4，5，6，7，8，9，10，11)的PDA平板上(用1 M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))，28 ℃培養(yǎng)至第5天時采用十字交叉法測量菌落直徑，第10天時血球計數(shù)板法測定產(chǎn)孢量。每個處理重復(fù)4次。

1.5.3 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 采用真菌生理培養(yǎng)基(氮源1 g、碳源5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL)。以硝酸鉀為氮源，將直徑7 mm的菌絲分別接種在分別含葡萄糖、淀粉、蔗糖、果糖、甘露醇、麥芽糖和甘油等作為不同碳源的培養(yǎng)基中，分別測定8種碳源時對微生物生長的影響，以無碳源培養(yǎng)基為對照。以葡萄糖為碳源，將直徑7 mm的菌絲分別接種到含酵母膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素、硝酸鉀和硝酸鈉等不同氮源的培養(yǎng)基中，分別測定7種氮源對微生物生長的影響，以無氮源培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)溫度均為28 ℃，到第5天時測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況。每個處理重復(fù)4次。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用DPS6.55軟件進行數(shù)據(jù)分析，Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀 該病主要危害石斛葉片。葉片感病初期出現(xiàn)深褐色圓形小點，后逐漸變大形成深褐色近圓形或不規(guī)則形凹陷病斑，病斑邊界清晰，后期病斑上散生許多黑色小點。濕度增大時，病斑上出現(xiàn)橙紅色黏性物。病斑密集的葉片褪綠，之后脫落(圖1A)。該病全年發(fā)生，以5—7月甚為流行。

2.2 病原菌的分離和致病性測定 對7個鐵皮石斛葉片病害樣進行病原分離，分離純化后得到4株形態(tài)學(xué)特征一致的菌株。經(jīng)針刺法接種到離體葉片上后，發(fā)病率可達100%。接種第7天葉片開始表現(xiàn)癥狀，在接種部位形成黑色近圓形病斑。田間接種10 d后，3個重復(fù)的發(fā)病株依次為114株、121株、119株；發(fā)病率均在80%以上。其癥狀與自然發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致(圖1B)，且分離接種致病植株能再次分離出與接種菌株形態(tài)一致的病原菌。對照組無表現(xiàn)癥狀。

圖1 鐵皮石斛炭疽病田間發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，該病原菌菌落呈圓形，菌絲排列整齊，毛絨狀(圖2A)，菌絲初為白色，后漸變?yōu)榛野咨蛏罨疑?。培養(yǎng)7 d后，靠近菌落中央產(chǎn)生輪狀排列的分生孢子盤，并產(chǎn)生紅色分生孢子團(圖2B)。附著孢卵圓形深褐色，(5.6～11.8)μm×(4.1～6.7)μm(圖2C)。分生孢子為圓柱近橢圓形，無色，單胞，兩端鈍圓，(11.2～15.7)μm×(4.1～6.1)μm(圖2D)。鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloesporioides(Penz.)。

圖2 病原菌菌落/附著胞和分生孢子的形態(tài)特征

2.4 分子生物學(xué)鑒定 病原菌的rDNA通過PCR擴增后，對擴增產(chǎn)物進行測序，獲得551bp的DNA序列(GenBank登入號為KP229358.1)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對。結(jié)果顯示，菌株與登入號為JN687987.1(Colletotrichumgloeosporioides)的菌株相似性最高，達99%。進一步構(gòu)建炭疽菌不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示SH-2菌株與引起苦瓜炭疽病的C.gloeosporioides菌株(登入號為JN687987.1)遺傳距離最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支(圖3)。

ITS序列分析證實菌株SH-2為Colletotrichumgloeosporioides，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果認(rèn)為引起鐵皮石斛炭疽病的病原菌為半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬的膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

注：分支點上的數(shù)字代表基于1000次重復(fù)的Bootstrap自舉值圖3 炭疽菌不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1 溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 鐵皮石斛炭疽病病原菌菌絲在不同溫度條件下培養(yǎng)5 d，菌絲生長量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(圖4)。在5 ℃時，病原菌菌絲直徑仍為接種時大小；在10 ℃時，病原菌菌絲開始向外蔓延，擴展直徑可達10 mm；在15～28 ℃時，菌絲直徑隨溫度升高逐漸變大；至28 ℃時菌絲生長量最大，擴展直徑可達52 mm；在28～35 ℃，菌絲生長隨溫度升高而急劇下降，35 ℃下菌絲生長已非常緩慢，菌絲未見明顯擴展。說明該致病菌在低于5 ℃或高于35 ℃時，菌絲生長均受溫度條件限制；菌絲生長的溫度范圍為10～35 ℃，最適生長溫度范圍為15～30 ℃。該病原菌產(chǎn)孢溫度范圍為15～35 ℃，其中最適產(chǎn)孢溫度為25～30 ℃。在15～30 ℃時，其產(chǎn)孢量隨溫度升高而增加，到達其最適產(chǎn)孢溫度30 ℃時產(chǎn)孢量可達26×106個。從30 ℃上升到35 ℃時，產(chǎn)孢數(shù)量迅速下降，溫度對其產(chǎn)孢能力破壞明顯(圖4)。

注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差圖4 不同溫度對鐵皮石斛炭疽菌生長和產(chǎn)孢的影響

2.5.2 pH值對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 鐵皮石斛炭疽病病原菌在pH值為3～11的PDA培養(yǎng)基上均能生長和產(chǎn)孢，但生長狀態(tài)不盡相同，酸性條件更適宜其產(chǎn)孢，尤其是pH值為3～4時其產(chǎn)孢量最大；而菌絲最適生長pH值為5～6(圖5)。

圖5 不同pH培養(yǎng)基對鐵皮石斛炭疽菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.3 不同碳源對菌絲生長的影響 膠孢炭疽菌對各種碳源均有較好的利用能力，菌絲生長良好，菌落直徑顯著高于對照(P<0.05)。該結(jié)果說明此菌對碳源要求不嚴(yán)格，能利用多種碳源，但利用能力有差異，利用能力由高到低依次為麥芽糖，果糖，葡萄糖，蔗糖，淀粉，甘露醇，乳糖，甘油，瓊脂對照(表1)。

表1 不同碳源對鐵皮石斛炭疽菌菌絲生長的影響

注：鄧肯氏新復(fù)極差檢驗，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01),標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.5.4 不同碳源培養(yǎng)基上菌落特征 膠孢炭疽菌在葡萄糖、蔗糖、果糖培養(yǎng)基上菌落灰白色，絮狀、菌絲生長茂盛，葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基中絮狀菌落邊緣比較整齊；果糖培養(yǎng)基中菌落邊緣呈折扇狀。在麥芽糖、淀粉培養(yǎng)基中的絮狀菌落菌絲茂盛，邊緣整齊，呈現(xiàn)灰青色。在乳糖培養(yǎng)基上菌落灰青色，氈狀，質(zhì)密，邊緣整齊。在甘油培養(yǎng)基上菌落青綠色，氈狀，質(zhì)密，邊緣整齊。在甘露醇培養(yǎng)基上菌落乳白色，氈狀，邊緣整齊。所有碳源培養(yǎng)基上均無明顯輪紋產(chǎn)生。在對照培養(yǎng)基上菌落稀疏，白色，生長較差(圖6)。

圖6 不同碳源培養(yǎng)基上鐵皮石斛炭疽病原菌菌落特征

2.5.5 不同氮源對菌絲生長的影響 硫酸銨、氯化銨作為氮源培養(yǎng)基明顯不利于膠孢炭疽菌菌絲生長(P<0.05)，其他供試氮源均對該菌菌絲生長有顯著促進作用(P<0.05)。說明該菌可以利用多種氮源，但對不同氮源利用能力存在顯著差異，由高到低依次為蛋白胨，酵母膏，硝酸鉀，尿素，硝酸鈉，瓊脂對照，硫酸銨，氯化銨。(表2)

2.5.6 不同氮源培養(yǎng)基上的菌落特征 膠孢炭疽菌在對照瓊脂培養(yǎng)基上菌落灰黑色，菌絲質(zhì)密，生長不旺盛；在硝酸鉀培養(yǎng)基上菌落灰白色，絮狀、菌絲生長茂盛，邊緣整齊；在蛋白胨和酵母膏培養(yǎng)基上菌落灰白色，絮狀，菌絲生長旺盛，邊緣整齊；尿素培養(yǎng)基上菌落白色，絮狀、菌絲生長茂盛，邊緣整齊；硝酸鈉培養(yǎng)基上菌落白色，絮狀、菌絲生長茂盛，邊緣整齊；在硫酸銨、氯化銨培養(yǎng)基上菌落白色，質(zhì)密，邊緣略顯褶皺。所有氮源培養(yǎng)基上均無明顯輪紋產(chǎn)生(圖7)。

表2 不同氮源對鐵皮石斛炭疽菌菌絲生長的影響

注：鄧肯氏新復(fù)極差檢驗，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01),標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

圖7 氮源培養(yǎng)基上石斛炭疽病菌特征

3 結(jié)論與討論

對于石斛炭疽病病原的研究，國內(nèi)外報道較少，張翊 等[6]對采自金釵石斛的病原進行了鑒定，認(rèn)為病原為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。膠孢炭疽菌是引起多種經(jīng)濟作物炭疽病的病原菌，在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)生的柱花草炭疽病、杧果炭疽病、橡膠炭疽病等都是由真菌引起的[5-13]。鐵皮石斛炭疽病，在國內(nèi)只見王艷對鐵皮石斛與炭疽菌的互作機制作過研究[14]，其他報道較少。能準(zhǔn)確鑒定病原炭疽病菌(Colletotrichum) 對于植物炭疽病的防控相當(dāng)重要，傳統(tǒng)的病原鑒定方法采用形態(tài)學(xué)鑒定，但其形態(tài)特性因?qū)嶒灧椒ê蜅l件不同而受到影響，鑒定結(jié)果常有偏差，現(xiàn)代分子生物學(xué)基于rDNA-ITS測序為病原菌的準(zhǔn)確鑒定提供了穩(wěn)定而可靠的方法，本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與rDNA-ITS 測序鑒定方法相結(jié)合，證實鐵皮石斛炭疽病的病原菌為半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬的膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

膠孢炭疽菌菌絲的生長溫度范圍為10～35 ℃，最適生長溫度范圍為15～30 ℃；15～28 ℃時，菌絲直徑隨溫度升高逐漸變大，至28 ℃時菌絲生長量最大；28～35 ℃時，菌絲生長隨溫度升高而急劇下降，35 ℃下菌絲生長已非常緩慢。該菌落生長的最高溫度與黃炳金 等[15]對銀杏炭疽病菌及雷百戰(zhàn) 等[16]對新疆葡萄炭疽病菌的研究結(jié)果基本一致。鐵皮石斛炭疽菌在pH值為3～11的PDA培養(yǎng)基上均能生長和產(chǎn)孢，但菌絲最適生長pH值為5～6，酸性條件更適宜其產(chǎn)孢，pH值為3～4時產(chǎn)孢量最大，此結(jié)果與楊葉[17]對香蕉果實炭疽菌的研究是一致的。

膠孢炭疽菌對各種碳源均有較好的利用能力，對碳源要求不嚴(yán)格，在供試的幾種碳源中菌絲生長良好，但以麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖最利于產(chǎn)生菌絲。在不同氮源條件下，蛋白胨是最利于菌絲生長及產(chǎn)生分生孢子的氮源；硫酸銨、氯化銨作為氮源的培養(yǎng)基明顯不利于石斛炭疽菌菌絲生長。

從膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性室內(nèi)測定可預(yù)知，田間溫度變化與石斛炭疽病流行有密不可分的關(guān)系，高溫高濕的氣候條件有利于該病流行。因此，高溫高濕季節(jié)應(yīng)加強該病的防控工作。通過對石斛炭疽病病原鑒定及其病原的生物學(xué)特性研究，可為今后研究該病的內(nèi)部發(fā)病機制如蛋白組學(xué)、基因組學(xué)等方面提供參考。