連勇軍 鄒良玉 歐藝 趙亞麗

(1深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518020；2深圳市福永人民醫(yī)院內(nèi)二科)

研究表明，2型糖尿病患者發(fā)展為阿爾茨海默病(AD)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加〔1〕，AD患者中包括胰島素在內(nèi)的多種代謝激素水平有明顯變化，比如皮質(zhì)醇和瘦素〔2～6〕。用胰島素或相關(guān)的代謝激素恢復(fù)腦部胰島素信號(hào)傳導(dǎo)可能為AD患者提供益處。胰島淀粉樣多肽能通過血腦屏障，小鼠中胰島淀粉樣多肽的腦攝取量約為胰島素的3倍，其受體廣泛分布在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，在大腦最后區(qū)，孤束核，臂旁核，杏仁核，下丘腦，伏隔核和背側(cè)切片中有最高密度的胰島淀粉樣多肽結(jié)合〔7〕。胰島淀粉樣多肽具有抗焦慮和抗抑郁〔8〕的作用及鎮(zhèn)痛特性〔9〕，但是這些作用機(jī)制尚未完全了解。在外周組織和CNS中，胰島淀粉樣多肽與胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)相互作用，激活胰島素的下游靶標(biāo)，比如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3，腺苷一磷酸(AMP)激活蛋白激酶(AMPK)和蛋白激酶B(Akt)級(jí)聯(lián)，參與細(xì)胞代謝和存活〔10〕。除了胰島素信號(hào)通路之外，胰島淀粉樣多肽也是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的調(diào)節(jié)器，這與海馬體的突觸可塑性和記憶鞏固密切相關(guān)〔11，12〕。本研究探討胰島淀粉樣多肽類似物普蘭林肽對(duì)SAMP8小鼠的記憶效應(yīng)，通過分析體內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)變化，驗(yàn)證受體功能，確定與改善認(rèn)知相關(guān)的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 醋酸普蘭林肽購自Sigma公司；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)5，p35/p25蛋白，突觸蛋白(Synapsin)Ⅰ，血紅素加氧酶(HO)-1，磷酸化(p)-ERK1/2和ERK1/2抗體購自CST公司；二抗購自北京中杉金橋生物有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒及電化學(xué)發(fā)光液購自上海碧云天生物公司；滲透性泵購自Alzet公司；神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal-A)、B27購自美國Gibco公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡SAMP8小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。集體飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，給予晝夜各12 h的光線變化，正常溫控，自由飲水?dāng)z食。SAMP8小鼠隨機(jī)分為普蘭林肽組或生理鹽水組，每組10只，實(shí)驗(yàn)周期共5 w。將Alzet微型滲透壓泵手術(shù)植入實(shí)驗(yàn)小鼠皮下，每天輸注0.25 mg/kg醋酸普蘭林肽(0.6 mg/ml)或生理鹽水，速度為0.5 ml/h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程每2 w換1次新的填充泵。所有動(dòng)物每周稱重。

1.3物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 在5 w實(shí)驗(yàn)期的最后1 w，進(jìn)行物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)動(dòng)物行為。測(cè)試設(shè)置包括4個(gè)相鄰的開放式箱子，間接昏暗照明。在訓(xùn)練前1天，將小鼠單獨(dú)置于1個(gè)箱子中，適應(yīng)15 min。第2天，在箱子底部一側(cè)相對(duì)放入2個(gè)相同物體，將小鼠背對(duì)物體放入箱子中，允許小鼠探索環(huán)境10 min，在此期間，開啟錄像設(shè)備，用跟蹤系統(tǒng)記錄其運(yùn)動(dòng)軌跡。每次試驗(yàn)后，用70%乙醇清洗物體和開放箱子以消除任何嗅覺影響。3 h后進(jìn)行測(cè)試試驗(yàn)。小鼠再次被放置在箱子中，但是，一個(gè)類似大小和復(fù)雜性的新物體取代了訓(xùn)練期間兩個(gè)相同物體中的一個(gè)。允許小鼠探索環(huán)境5 min，然后將其放回籠中。記錄訓(xùn)練和測(cè)試期間小鼠探索物體的時(shí)間，即距離物體2 cm范圍內(nèi)的持續(xù)時(shí)間。辨別指數(shù)計(jì)算公式為：(N-F/N+F)，N表示動(dòng)物探索新物體的時(shí)間，F(xiàn)表示動(dòng)物探索熟悉物體的時(shí)間。

1.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，解剖取出大腦組織，分離海馬體。在加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿，離心，取上清，用BCA試劑盒對(duì)蛋白定量。在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中進(jìn)行分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%牛奶中封閉1 h后，將膜置于稀釋的抗體中，在4℃下孵育過夜，隨后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h，通過電化學(xué)發(fā)光法顯色，分析目的條帶光密度值。主要檢測(cè)Cdk5，p35，p25，Synapsin I，HO-1，p-ERK1/2和總ERK1/2表達(dá)量，選用β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.5免疫組化實(shí)驗(yàn) 取12只小鼠隨機(jī)分成兩組：普蘭林肽組和生理鹽水組，連續(xù)給藥2 w后處死。 解剖小鼠，取出大腦組織，用4%多聚甲醛固定24 h，然后置于30%蔗糖溶液(4℃)中3 d，切成40 μm的矢狀切片，貼片。清洗后，在1%的過氧化氫溶液中孵育1 h，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，用3%牛血清白蛋白(BSA)+0.5%Triton封閉1 h，加入稀釋的人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)抗體和環(huán)氧化物酶(COX)-2抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，然后二抗溫育2 h。使用親和素-生物素-過氧化生物酶復(fù)合物(ABC)試劑和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒完成染色，顯微鏡下觀察。

1.6大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 從孕18 d SD大鼠胚胎中分離出大腦皮質(zhì)，剪碎，胰蛋白酶消化，并制成單細(xì)胞懸液。將神經(jīng)元細(xì)胞接種到6孔板，置于含2%B27的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal-A)中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，加入不同濃度的普蘭林肽平行處理1 h或3 h，然后將細(xì)胞裂解，離心收集上清，并進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1普蘭林肽處理改善SAMP8小鼠物體識(shí)別的記憶功能 與探索熟悉物體所需時(shí)間相比，在探索新穎物體時(shí)，普蘭林肽組花費(fèi)更長的時(shí)間，而生理鹽水組小鼠探索新穎物體和熟悉物體花費(fèi)的時(shí)間沒有太大區(qū)別。兩組辨別指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(0.68±0.02)vs(0.49±0.04),P<0.05〕。

2.2普蘭林肽降低SAMP8小鼠海馬體中炎癥標(biāo)志物的表達(dá)量 與生理鹽水組(0.21±0.03)相比，普蘭林肽處理組HO-1蛋白表達(dá)量顯著降低(0.17±0.01,P<0.05)，普蘭林肽組小鼠海馬體中COX-2表達(dá)較生理鹽水組顯著降低〔(2.9±0.3)vs(5.0±0.3),P<0.05〕;兩組小鼠海馬體中HNE水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(2.5±0.4)vs(3.7±0.5),P>0.05〕，見圖1，圖2 。

圖2 兩組COX-2和HNE表達(dá)(×400)

2.3普蘭林肽增加SAMP8小鼠海馬體中SynapsinⅠ表達(dá) 與生理鹽水組(0.86±0.12)比較，普蘭林肽組海馬體中SynapsinⅠ表達(dá)顯著增加(1.17±0.15，P<0.01)。見圖3。與生理鹽水組(0.58±0.08)比較，普蘭林肽組Cdk5表達(dá)顯著增加(0.85±0.11，P<0.01)。生理鹽水組與普蘭林肽組比較p35(0.23±0.05 vs 0.31±0.04)、p25(0.67±0.07 vs 0.83±0.06)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 Western印跡檢測(cè)SynapsinⅠ蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測(cè)Cdk5、p25、p35蛋白表達(dá)

2.4普蘭林肽增加小鼠大腦皮質(zhì)原代神經(jīng)元細(xì)胞中Cdk5的表達(dá) 不同濃度的普蘭林肽孵育細(xì)胞1 h和3 h后，顯著增加了神經(jīng)元中Cdk5的表達(dá)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。普蘭林肽作用3 h增加了p-ERK1/2的表達(dá)。見表1、圖5。

表1 不同濃度普蘭林肽對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)原代神經(jīng)元細(xì)胞中Cdk5及p-ERK1/2表達(dá)的影響

與0 nmol/L比較：1)P<0.05

圖5 不同濃度普蘭林肽對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)原代神經(jīng)元細(xì)胞中Cdk5和p-ERK1/2表達(dá)的影響

3 討 論

在AD患者血漿樣本中，低胰島淀粉樣多肽水平與AD存在顯著關(guān)聯(lián)〔11〕。本研究結(jié)果表明：在物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，普蘭林肽作用改善了小鼠的認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶過程。遇到熟悉或新奇物體的探究能力，并不是一般的活動(dòng)變化，是與認(rèn)知相關(guān)的，并且取決于內(nèi)側(cè)顳葉功能的完整性〔13〕，內(nèi)側(cè)顳葉是一個(gè)受早期和晚期AD影響的區(qū)域。所以，這些發(fā)現(xiàn)顯示普蘭林肽可能有益于治療散發(fā)型AD患者。

長期給予普蘭林肽能夠改善AD的重要病理特征，包括突觸損害和氧化應(yīng)激。在AD的發(fā)病機(jī)制中，炎癥反應(yīng)和突觸損害兩種病理過程均存在于SAMP8小鼠的海馬組織中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在SAMP8小鼠中，普蘭林肽處理組顯著降低了HO-1的表達(dá)。HO-1是一種在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)期間被激活的細(xì)胞應(yīng)激蛋白，在AD患者的大腦皮層和海馬體中表達(dá)增加，并且在SAMP8小鼠中呈年齡依賴性增加〔14〕。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，普蘭林肽降低了海馬體中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物HNE的含量，HNE是一種已知的AD大腦中早期大量存在的細(xì)胞應(yīng)激標(biāo)記物。COX-2在老齡化和AD大腦中逐漸增加的經(jīng)典炎癥標(biāo)志物，其表達(dá)量明顯降低。

海馬體中SynapsinⅠ是一種位于神經(jīng)元突觸小泡中的蛋白質(zhì)，其與突觸的形成，神經(jīng)遞質(zhì)釋放，學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)〔15〕。普蘭林肽處理的SAMP8小鼠中SynapsinⅠ表達(dá)的增加，說明普蘭林肽對(duì)突觸有保護(hù)作用或誘導(dǎo)突觸發(fā)生。Cdk5是一種脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與新皮質(zhì)發(fā)育過程中的樹突生長和神經(jīng)細(xì)胞遷移〔16〕，同時(shí)在成人大腦的突觸可塑性，學(xué)習(xí)和記憶中也發(fā)揮重要作用。在普蘭林肽處理的大腦皮質(zhì)原代神經(jīng)元細(xì)胞中，Cdk5的表達(dá)呈劑量依賴型，說明大腦海馬體和皮層神經(jīng)元中Cdk5的強(qiáng)勁增長可能是普蘭林肽發(fā)揮作用的分子機(jī)制。Cdk5與突觸小泡循環(huán)，神經(jīng)遞質(zhì)合成，軸突運(yùn)輸，神經(jīng)元的存活和細(xì)胞死亡及海馬神經(jīng)再生密切相關(guān)。已有研究表明，Cdk5在突觸形成中起重要作用〔17〕，很可能是由于它對(duì)SynapsinⅠ的下游效應(yīng)。 雖然Cdk5被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用，但分裂產(chǎn)物p25的積累，導(dǎo)致Cdk5失調(diào)，引起Tau蛋白和神經(jīng)元過度磷酸化〔18〕。

本研究中，普蘭林肽對(duì)p25或p35的表達(dá)并沒有顯著影響，表明普蘭林肽可以選擇性地增加Cdk5的表達(dá)，而不促進(jìn)該激酶的失調(diào)。下一步的研究需要確定普蘭林肽對(duì)Tau蛋白磷酸化的影響，并確定Cdk5是否是影響突觸可塑性標(biāo)志物如SynapsinⅠ變化的因素。

綜上，胰島淀粉樣類似物普蘭林肽能夠改善散發(fā)型AD小鼠模型的認(rèn)知缺陷，減少炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激標(biāo)志物，增加海馬組織Synapsin的表達(dá)，并與Cdk5的表達(dá)有密切關(guān)系，這為AD的研究和治療提供新思路、新途徑。