高秋珍 胡東陽 陳麗平 張建新

(1許昌學院醫(yī)學院，河南 許昌 461000;2許昌市中心醫(yī)院兒科;3許昌學院創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)學院)

Ⅱ型肺泡上皮細胞(AEC2)功能障礙被認為是多種難治性肺部疾病的主要病因。Whitsett等〔1〕研究表明，肺表面活性蛋白(SFTP)C、SFTPB和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(ABC)A3等在AEC2s中高度表達的基因發(fā)生突變，會導致新生兒呼吸窘迫或早發(fā)性間質(zhì)性肺疾病。從對這些基因突變患者的研究中證實，AEC2s損傷為早期肺泡功能障礙導致的多種肺部疾病的機制研究提供思路〔2～4〕。盡管AEC2s的原代培養(yǎng)在疾病的研究與治療中必不可少已被廣泛認可，但獲得純化的功能性AEC2s用于移植治療的目標尚未完全實現(xiàn)〔5〕。Foster等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)從人肺中體外分離的AEC2s分裂增殖能力較差，且多數(shù)轉(zhuǎn)分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞(AEC1s)。Barkauskas等〔7〕在體外培養(yǎng)AEC2s的過程中發(fā)現(xiàn)要維持AEC2s的表型需要模擬間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)條件。由于在發(fā)育中的人胚胎肺組織中也難以分離獲得AEC2s，因而無法用鼠類的肺組織發(fā)育中的AEC2s來有效模擬人類肺發(fā)育中AEC2s〔8〕。基于此，肺泡發(fā)育與疾病研究受到很大程度的限制，也阻礙了AEC2s損傷引起的相關疾病治療的發(fā)展。

肺泡內(nèi)的AEC2s在肺氣體交換中具有重要作用，是肺泡內(nèi)的兼性祖細胞，通過自我更新與分化為AEC1s來修復小鼠肺實質(zhì)的損傷；通過合成分泌表面活性物質(zhì)調(diào)節(jié)肺泡表面張力；通過特異性免疫反應防止感染發(fā)生〔9〕。雖然在AEC2s中有多種表面活性蛋白(SPC)表達，但只有SPC被證實具有高度特異性，不僅在成人AEC2s中有特異表達，在人胚發(fā)育早期的肺組織和鼠胚發(fā)育中的肺芽中均有表達〔10〕。成熟的AEC2s不僅有SFTPC表達，還具有加工表面活性物質(zhì)的細胞器，二者均為AEC2s的功能性標志。盡管石莉等〔11〕已經(jīng)成功將脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化為AEC2s，并證實Wnt信號通路分子可促進分化，但未對分化形成的AEC2s活性進行檢測。至今，尚未有脂肪間充質(zhì)干細胞來源的AEC2s是否具有活性的相關報道。

由于脂肪間充質(zhì)干細胞具有易獲取、來源豐富、無免疫排斥等優(yōu)點，已作為組織損傷修復和生物組織重構(gòu)的理想種子來源〔12〕。脂肪間充質(zhì)干細胞及其定向分化為有活性的AEC2s將為肺組織工程學研究提供機會。本研究擬探討脂肪間充質(zhì)干細胞在NA作用下向有活性的AEC2s分化的情況。

1 材料和方法

1.1試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、低糖DMEM購自美國Gibco公司；間充質(zhì)干細胞專用胎牛血清、胎牛血清購自美國Hyclone公司；NA、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；小氣道上皮細胞生長基礎培養(yǎng)基購自德國Promocell公司；Transwell培養(yǎng)板購自美國Corning公司；兔抗大鼠CD29、CD44、CD34、CD31、SPC抗體購自美國Abcam公司；羊抗兔Alexa Fluor?568抗體購自美國Santa Cruz公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Shellab公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標儀美國購自Thermo Fisher公司。

1.2實驗動物 SPF級4周齡SD大鼠，體重60～90 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。

1.3大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定 大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分離與培養(yǎng)根據(jù)文獻〔13,14〕報道方法進行改良，無菌條件下切取5只已麻醉的SD大鼠腹腔脂肪組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)快速沖洗，將脂肪組織剪碎放置于培養(yǎng)皿內(nèi)，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃搖床震蕩消化1 h，完全培養(yǎng)基終止消化后用150目細胞篩過濾，收集濾液，1 500 r/min離心5 min，取細胞沉淀物用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，重復離心1次，重懸細胞后以6×106/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h后，全量更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合達80%，期間每隔1 d換1次。傳代前用PBS沖洗細胞，去掉懸浮細胞，用0.25%胰蛋白酶將培養(yǎng)皿底部的細胞消化至圓形，完全培養(yǎng)基終止消化后，1 000 r/min離心3 min，以1∶2的比例傳代。

參照文獻〔15～17〕報道的方法，取第3代脂肪間充質(zhì)干細胞進行鑒定。收集細胞，PBS洗滌3次，用PBS重懸細胞制成濃度為1×109/L的100 μl細胞懸液，嚴格參照說明書步驟分別加入兔抗大鼠CD29、CD44、CD34、CD31單克隆抗體和同型對照，4℃避光孵育30 min，PBS漂洗3次，流式細胞儀檢測以上細胞表面標志物的陽性表達率。脂肪間充質(zhì)干細胞成脂誘導分化及鑒定：向低糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、0.5 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、10 μmol/L胰島素配制成脂誘導培養(yǎng)基，用此培養(yǎng)基培養(yǎng)第3代脂肪間充質(zhì)干細胞，期間每隔2天換1次培養(yǎng)基，21 d后PBS洗滌細胞，預冷4%多聚甲醛固定10 min，油紅O染液染色60 min，75%乙醇脫色、晾干、封片、顯微鏡下觀察。脂肪間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化及鑒定：向低糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸配制成骨誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)第3代脂肪間充質(zhì)干細胞，每隔3 d換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)28 d后取細胞用預冷4%多聚甲醛固定10 min，茜素紅S染液染色30 min，蒸餾水沖洗、晾干、封片、顯微鏡下觀察。

1.4大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞向AEC2s分化 大鼠原代AEC2s分離培養(yǎng)：無菌條件下取出新生SD大鼠的肺組織，PBS沖洗后放入含預冷培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將肺組織剪碎后放入胰蛋白酶溶液中消化40 min，用DMEM培養(yǎng)基終止消化，200目篩網(wǎng)過濾去除未消化的結(jié)締組織，將濾液1 000 r/min離心10 min，取細胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，以5×105/cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)3 d，換液去除懸浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d半量換培養(yǎng)基，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部進行1∶2的比例傳代。

大鼠AEC2s原代培養(yǎng)過程中，約36 h即可出現(xiàn)貼壁生長，細胞呈梭形、三角形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯，出現(xiàn)以梭形為主的多種形態(tài)，10～14 d 70%～80%可融合達到傳代標準。傳代細胞形態(tài)單一，呈梭形或扁平型，增殖至細胞融合時呈漩渦狀和放射狀排列。大鼠原代AEC2s的鑒定：取生長狀態(tài)良好的原代AEC2s，預冷的4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，10%山羊血清室溫封閉30 min去除非特異性抗原，棄去血清后加入兔抗大鼠SPC多克隆抗體(1∶100)4℃孵育，次日取出用PBS洗滌3次，每次3 min，滴加羊抗兔Alexa Fluor?568抗體室溫避光孵育30 min，PBS漂洗3次，每次3 min；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染核5 min，PBS漂洗、封片、熒光顯微鏡下觀察。

大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞向AEC2s分化：參照文獻〔14,18,19〕報道的方法進行改良，將大鼠原代AEC2s接種于6孔培養(yǎng)板各孔的底部，將大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞以1×103/cm2接種于Transwell培養(yǎng)板底部后放置于6孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)進行共培養(yǎng)，向小氣道上皮細胞生長基礎培養(yǎng)基中分別加入4 ml/L牛腦垂體提取液、10 μg/L表皮生長因子、5 ng/L胰島素、0.5 ng/L 腎上腺素、0.5 ng/L氫化可的松、10 ng/L運鐵蛋白、0.006 ng/L三碘甲狀腺原氨酸、0.1 g/L維A酸、2.5 g/L牛血清白蛋白配制的誘導分化培養(yǎng)液，同時向誘導分化培養(yǎng)液中加入10 mmol/L NA，37℃、5%CO2共培養(yǎng)，每隔1天換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d取Transwell培養(yǎng)板底部的細胞，胰酶消化制成細胞懸液進行各項鑒定，不添加NA的共培養(yǎng)組為對照組。

1.5誘導分化的AEC2s的鑒定 細胞免疫熒光染色檢測SPC蛋白在誘導分化AEC2s中的表達：方法同上述大鼠原代ACE2s的鑒定方法。

流式細胞術(shù)檢測SPC陽性細胞百分率：方法同上述大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞表面標記物的鑒定方法。透射電鏡檢測誘導分化AEC2s的特征結(jié)構(gòu)：將誘導分化的AEC2s細胞用預冷的2.5%戊二醛室溫固定90 min，常規(guī)脫水、包埋、超薄切片、水合醋酸鈾染色5 min、檸檬酸鉛染色10 min，透射電鏡下觀察細胞微細結(jié)構(gòu)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測共培養(yǎng)上清液中SPC含量：培養(yǎng)第14 d，將共培養(yǎng)體系中的Transwell培養(yǎng)板取出放入沒有接種大鼠原代AEC2s的6孔板的各孔中，繼續(xù)使用相同成分的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，隨后收集培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心5 min，分別將上清液和標準品加入樣品孔，滴加SPC抗體，孵育、漂洗、加入底物、終止反應，酶標儀在450 nm處測量吸光度值(A)，根據(jù)標準曲線計算SPC含量。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的鑒定 倒置相差顯微鏡觀察顯示，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞約在培養(yǎng)4 h后開始貼壁，24 h后貼壁生長的細胞呈梭形，體積較??；48 h后細胞集落形成，細胞體積增大，突起增多；72 h后細胞集落增大，細胞呈漩渦狀排列，集落邊緣細胞呈長梭形；傳代后的細胞大小一致，形態(tài)無明顯變化。 成脂誘導培養(yǎng)21 d后，細胞油紅O染色結(jié)果顯示，細胞胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的紅色油滴，表明分離的干細胞具有成脂能力；成骨誘導培養(yǎng)28 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，細胞集落中散在分布有大小不一的暗紅色鈣結(jié)節(jié)(圖1)，說明細胞具有成骨能力。所收集的大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞中黏附分子CD44和CD29的陽性表達率分別為99.98%和98.97%，內(nèi)皮細胞系標志物CD31呈陰性表達(陽性表達率為0.36%，低于5%均視為陰性表達)，造血細胞系標志物CD34呈陰性表達(陽性表達率為0.31%)，說明本研究分離的細胞是起源于中胚層的脂肪間充質(zhì)干細胞，純度較高。

2.2大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化的AEC2s形態(tài) 大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞與大鼠原代AEC2s共培養(yǎng)48 h后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞兩端轉(zhuǎn)向鈍圓形，細胞間開始出現(xiàn)縫隙；共培養(yǎng)7 d后，長梭形細胞減少，三角形細胞數(shù)量增多，細胞間隙增大，分散排列；共培養(yǎng)14 d，細胞由長梭形變?yōu)槎噙呅?，偶爾可見細胞邊界變圓，胞質(zhì)亮度變暗。見圖2。

2.3大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化的AEC2s的鑒定 為了驗證是否將大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞成功誘導分化為AEC2s，本研究首先檢測AEC2s的特異性標志蛋白SPC在Transwell培養(yǎng)板底部細胞中的表達，免疫熒光染色結(jié)果顯示，誘導分化的細胞胞質(zhì)中有SPC的陽性表達呈紅色(圖3A)，而未經(jīng)誘導分化的大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞中SPC呈陰性表達(圖3B)；進一步的透射電鏡結(jié)果顯示，誘導分化的細胞胞質(zhì)中可見電子密度高的橢圓形板層小體(圖3C)，是AEC2s的特征性結(jié)構(gòu)，而未經(jīng)誘導分化的大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞中無板層小體出現(xiàn)(圖3D)；以上結(jié)果說明經(jīng)誘導大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分化為AEC2s。

圖2 共培養(yǎng)不同時間點大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化的AEC2s形態(tài)(×200)

2.4NA對大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞向功能性AEC2s分化的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照組誘導分化培養(yǎng)14 d后，SPC蛋白陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的12.65%，NA組SPC蛋白陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的27.53%，兩組間細胞陽性率有顯著差異(P<0.01)，說明NA可提高脂肪間充質(zhì)干細胞向AEC2s誘導分化的效率。隨后，為了進一步觀察NA對誘導分化的AEC2s活性的影響，本研究采用ELISA法檢測單獨培養(yǎng)的AEC2s分泌SPC的功能，對照組上清液中SPC含量〔(9.07±1.39)ng/ml〕顯著低于NA組〔(21.56±3.80)ng/ml，P<0.01〕，說明NA可促進有活性AEC2s的誘導分化。

3 討 論

脂肪間充質(zhì)干細胞是成體間充質(zhì)干細胞之一，具有較強的多向分化潛能，可被誘導分化為骨、脂肪、胰島、肺泡上皮、骨骼肌、心肌、神經(jīng)細胞、肝細胞等多種組織細胞，結(jié)合其免疫調(diào)控功能，已應用于組織器官損傷修復的研究，而用于肺損傷修復的干細胞移植研究主要集中在骨髓和臍帶來源的間充質(zhì)干細胞〔20～23〕。與其他種類的成體干細胞相比，脂肪組織來源豐富、便于取材、損傷小；脂肪間充質(zhì)干細胞獲得率高、生物安全性好、自體移植容易，可滿足臨床大量多次的移植需求〔24〕。因此，分離獲取足夠數(shù)量的高純度脂肪間充質(zhì)干細胞在臨床應用中至關重要。 本研究說明采用傳統(tǒng)方法分離得到的脂肪間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，符合國際細胞治療專業(yè)機構(gòu)對間充質(zhì)干細胞的鑒定標準〔25〕，可用于進行誘導分化實驗。

NA是用于間充質(zhì)干細胞誘導分化的藥物，同時具有抗氧化和抗炎作用，參與細胞多種生物學活動〔26〕。穆長征等〔27〕將NA作為誘導藥物可將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為胰島素產(chǎn)生細胞。楊曉蕾等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)NA對人臍帶間充質(zhì)干細胞具有保護效應，可以減輕干細胞輸注損傷。楊萍等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)NA可促進脂肪來源干細胞向功能性類胰島細胞分化。湯習鋒等〔30〕研究表明NA可促進肝細胞DNA的復制，進而促進肝細胞的增殖。目前，將成體干細胞誘導分化為AEC2s的主要方法是與肺組織細胞共培養(yǎng)，但對功能性AEC2s的誘導分化的研究較少，尚未有關于NA在共培養(yǎng)體系中對脂肪間充質(zhì)干細胞誘導效率的相關報道。本研究結(jié)果表明脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化產(chǎn)生了有活性的AEC2s，此細胞有SPC蛋白表達，且在培養(yǎng)上清液中檢測到該細胞分泌的表面活性物質(zhì)。

肺泡表面活性物質(zhì)是AEC2s合成分泌的一類脂蛋白，其中,特異性最高的是SPC蛋白，由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，經(jīng)高爾基復合體加工后儲存于板層小體中，自細胞向肺泡腔的一側(cè)分泌，覆蓋在肺泡內(nèi)表面液體的表層，以降低肺泡表面張力〔31～33〕。本研究提示經(jīng)誘導分化的細胞具有AEC2s的特征。AEC2s中的板層小體是電鏡下的特征結(jié)構(gòu)，呈橢圓形板層狀，電子密度高，主要成分是二棕櫚酰卵磷脂〔34〕。本研究進一步驗證大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞經(jīng)共培養(yǎng)誘導后可分化為AEC2s樣細胞。細胞能有效發(fā)揮功能是臨床細胞移植治療的關鍵因素之一〔35〕。近年的研究開始關注功能性細胞的培養(yǎng)方法，主要通過藥物誘導或功能性原代細胞的共培養(yǎng)來實現(xiàn)〔36〕。本研究說明誘導分化的AEC2s具有合成分泌功能，結(jié)合形態(tài)學結(jié)果提示，誘導分化的AEC2s樣細胞具有細胞活性。隨后，本研究進一步說明NA可提高脂肪間充質(zhì)干細胞向AEC2s誘導分化的效率，可促進有活性AEC2s的誘導分化。本研究選取14 d作為終止誘導分化的主要原因是Transwell培養(yǎng)板面積有限，當細胞鋪滿培養(yǎng)板板底后開始發(fā)生生長抑制，細胞數(shù)量減少且活性降低，尋找適合大量培養(yǎng)的器皿將為AEC2s移植治療難治性肺部疾病奠定基礎。

綜上，本研究成功應用大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞建立了功能性AEC2s模型，并證實NA對大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的誘導分化具有促進作用。