唐洪波 王茜 唐洪焱 吳凱峰 黃貴川 張巍 陳微微 溫建立 劉代順

(1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種臨床多發(fā)、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭疾病，預(yù)后極差，病死率高達(dá)40%〔1〕，即便存活，后期往往發(fā)生不同程度肺纖維化改變，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重受損。以往認(rèn)為肺纖維化僅發(fā)生在ARDS晚期，ARDS早期(<7 d)肺部主要是滲出為主的病理改變，7 d后進(jìn)入增殖期，一般3 w可形成肺纖維化；但近來(lái)研究表明，ARDS的早期階段就已啟動(dòng)了肺纖維增生反應(yīng)〔2〕；而在ARDS早期針對(duì)纖維增生進(jìn)行治療有可能改善其預(yù)后〔3〕。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1是ARDS的一種生物標(biāo)志物，ARDS發(fā)生肺纖維化時(shí)肺組織活檢標(biāo)本中IGF-1表達(dá)水平增加〔4〕，靶向抑制IGF-1可減輕ARDS病變及后期的纖維化改變〔5〕。羅格列酮能抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其抗肺纖維化與羅格列酮激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ相關(guān)，但是否與影響IGF-1的表達(dá)目前罕有報(bào)道。本研究采用博來(lái)霉素制作小鼠ARDS模型，探討羅格列酮在ARDS肺纖維化中的保護(hù)作用及對(duì)PPARγ/IGF-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、處理方法及藥品 健康雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠40只，6～8周齡，體重20～25 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；羅格列酮(純度>99.5%)購(gòu)自Sigma Aldrich公司；博萊霉素為歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只，空白對(duì)照(Control)組：假手術(shù)+0.5%羥甲基纖維0.2 ml灌胃；模型(M)組：造模+0.5%羥甲基纖維0.2 ml灌胃；羅格列酮早期治療(M+L)組：造模+羅格列酮(5 mg/kg溶于0.2 ml 0.5%羥甲基纖維)灌胃。

1.2模型制作 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后造模：使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，頸部脫毛后用酒精消毒，縱行切開(kāi)頸前皮膚，鈍性分離暴露氣管，M組與M+L組氣管內(nèi)注入75 μl博萊霉素注射液(5 mg/kg)〔6〕，Control組注入等體積無(wú)菌生理鹽水，縫合切口，立即將小鼠直立適當(dāng)旋轉(zhuǎn)3 min，使藥物能夠均勻分布肺組織；小鼠意識(shí)恢復(fù)后正常喂養(yǎng)。造模24 h后給予相應(yīng)藥物：Control組、M組灌胃0.5%羥甲基纖維溶液，M+L組灌胃0.5%羥甲基纖維溶液溶解的羅格列酮5 mg/kg〔7〕，每組每天灌胃1次，連續(xù)給藥14 d。

1.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi) 造模第28天后，給予1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死小鼠后，暴露胸腔，結(jié)扎右肺組織肺門(mén)。充分暴露頸部氣管，做“V”形切口后放入靜脈留置針套管并結(jié)扎，0.9% NaCl溶液0.5 ml行支氣管肺泡灌洗3次，收集BALF以2 000 r/min，-4℃離心5 min，棄掉上清液，用6 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，計(jì)算每毫升的細(xì)胞數(shù)。再次以2 000 r/min，-4℃離心5 min，棄上清液，300 μl PBS 重懸細(xì)胞后涂片吉姆薩-瑞氏染色，油鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)，計(jì)算百分比，細(xì)胞總數(shù)乘以相應(yīng)的百分比即得到各分類(lèi)細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)值。

1.4肺組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠肺組織4%的多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，肺組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson染色，Masson染色具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，染色后膠原纖維為藍(lán)色采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定；纖維化程度評(píng)估按照Aschcroft〔8〕評(píng)分進(jìn)行。

1.5SQ-PCR檢測(cè)PPARγ/IGF-1 mRNA的表達(dá) 稱(chēng)取50～100 mg肺組織后Trizol試劑盒提取RNA，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 DNA：94 ℃預(yù)變性 3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)PCR循環(huán)，最后72℃總延伸10 min。引物序列為PPAR-γ上游：5′-GCCCTTTACCACAGTTGATTTC-3′，下游：5′-GATGCTTTATCCCCACAGACTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度252 bp；IGF-1上游：5′-GTAACCATGAGGCTGAGAAC-3′，下游：5′-AACACAGGTTCCGTCCATGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度254 bp；β-actin上游：5′-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3′，下游：5′-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度500 bp。

1.6免疫組化檢測(cè)肺組織PPARγ/IGF-1陽(yáng)性率表達(dá) 小鼠肺組織4%的多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，肺組織切片進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)肺組織PPARγ/IGF-1陽(yáng)性率表達(dá)，具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；免疫組化染色后陽(yáng)性為棕黃色顆粒，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性用SNK及LSD檢驗(yàn)，方差不齊用TamhaneT檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1羅格列酮對(duì)肺組織大體形態(tài)改變的影響 造模后小鼠逐漸出現(xiàn)呼吸急促、懶動(dòng)、進(jìn)食減少、體重減輕等；1 w后呼吸逐漸變慢并趨于平穩(wěn)，進(jìn)食逐漸增加，體重逐漸回升。28 d處死小鼠解剖提取肺組織，大體觀(guān)察Control組肺組織未見(jiàn)明顯病理改變，表面光滑，彈性良好，顏色呈淡粉色；M組肺組織體積縮小，彈性差，表面凹凸不平，見(jiàn)散在陳舊出血點(diǎn)及灰白色瘢痕樣改變；羅格列酮治療可減低上述改變。

2.2羅格列酮對(duì)BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)的影響 與Control組相比，M組BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)；M+L組較M組均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

組別總細(xì)胞數(shù)(×104)細(xì)胞分類(lèi) (×104)巨噬細(xì)胞數(shù)淋巴細(xì)胞數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)Control組22.29±0.8821.84±0.900.28±0.060 30.03±0.006 1M組96.25±3.521)91.68±3.881)3.99±0.580 81)0.57±0.050 81)M+L組69.00±2.001)2)66.92±2.231)2)1.84±0.293 71)2)0.24±0.049 71)2)

與Control組比較：1)P<0.05;與M組比較：2)P<0.05

2.3羅格列酮對(duì)肺組織纖維化的影響 肺組織HE染色見(jiàn)Control組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)充血、出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化等。M組可見(jiàn)部分肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔被滲出物填充，伴纖維組織增生；羅格列酮治療可減低炎癥及纖維化改變，見(jiàn)圖1。采用Aschroft法進(jìn)行纖維化等級(jí)評(píng)分，M組Aschroft評(píng)分〔(6.82±0.32)分〕較Control組〔(0.11±0.06)分〕明顯增加(P<0.05)，M+L組〔(5.42±0.33)分〕較M組減低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4羅格列酮對(duì)肺組織膠原蛋白表達(dá)的影響 Masson染色Control組肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則、整齊，未見(jiàn)小葉間隔增厚，肺組織內(nèi)無(wú)明顯藍(lán)色膠原纖維沉積；M組可見(jiàn)藍(lán)色膠原纖維在肺泡間隔及肺間質(zhì)中呈彌漫分布，并伴有肺泡結(jié)構(gòu)的破壞；羅格列酮治療可減低肺泡結(jié)構(gòu)破壞及藍(lán)色膠原纖維沉積。藍(lán)色膠原采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，M組膠原含量(OD值：67.06±9.27)明顯多于Control組(5.45±0.95，P<0.05)，M+L組(49.36±5.03)較M組明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.5羅格列酮對(duì)肺組織PPARγ、IGF-1陽(yáng)性表達(dá)率的影響 肺組織免疫組化染色見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞呈棕黃色，M組PPARγ陽(yáng)性表達(dá)(OD值：0.38±0.20)較Control組(1.69±0.10)顯著減低，IGF-1陽(yáng)性率表達(dá)(2.01±0.17)較Control組(0.34±0.08)顯著增加，M+L組(2.64±0.18)較M組PPARγ陽(yáng)性表達(dá)顯著增加，IGF-1陽(yáng)性率(1.54±0.13)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.6羅格列酮對(duì)肺組織PPARγ mRNA、IGF-1 mRNA表達(dá)的影響 肺組織SQ-PCR檢測(cè)見(jiàn)M組PPARγ mRNA表達(dá)(0.31±0.04)較Control組(0.56±0.03)顯著減低，IGF-1 mRNA表達(dá)(0.87±0.05)較Control組(0.15±0.01)顯著增加，M+L組(0.85±0.06)較M組PPARγ mRNA表達(dá)顯著升高，IGF-1 mRNA表達(dá)(0.54±0.04)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖1 各組肺病理組織HE染色(×100)

圖2 各組肺組織Masson染色(×100)

圖3 各組肺組織collagenⅠ 免疫組化染色(×400)

圖4 各組肺組織PPARγ、IGF-1 mRNA表達(dá)

3 討 論

ARDS是指伴有嚴(yán)重肺部炎癥的低氧性呼吸衰竭，包括內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的過(guò)度活化〔9〕；這些細(xì)胞的過(guò)度活化導(dǎo)致肺組織后期發(fā)生不同程度肺纖維化，嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活質(zhì)量。研究表明，ARDS的早期階段就已經(jīng)啟動(dòng)了肺纖維增生反應(yīng)，而在ARDS早期針對(duì)纖維增生進(jìn)行治療有可能改善其預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羅格列酮能降低博來(lái)霉素誘導(dǎo)的ARDS模型小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織纖維化改變及肺膠原蛋白的表達(dá)。

IGF-1是一種具有多種細(xì)胞功能的細(xì)胞因子，與受體IGF-1R結(jié)合后啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移等〔10〕。IGF-1信號(hào)傳導(dǎo)與大多數(shù)呼吸道慢性肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纖維化和肺癌等有關(guān)〔11～13〕。在肺損傷時(shí)IGF-1可調(diào)節(jié)氣道上皮再生過(guò)程中細(xì)胞的增殖和分化而發(fā)揮保護(hù)作用〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1和其受體的低水平表達(dá)的ARDS患者病情預(yù)后更好、死亡率更低〔15〕；靶向抑制IGF-1可減輕ARDS病變、后期纖維化改變，對(duì)肺泡損傷起保護(hù)作用，改善預(yù)后〔5〕。

大量研究已經(jīng)明確羅格列酮能抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其抗肺纖維化機(jī)制可能與羅格列酮激活PPARγ相關(guān)〔16～18〕，但是否與影響IGF-1的表達(dá)有關(guān)目前罕有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷羅格列酮抗肺纖維化的機(jī)制可能和激活PPARγ進(jìn)而抑制IGF-1的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，羅格列酮對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的ARDS具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)PPARγ，進(jìn)而抑制IGF-1表達(dá)，從而阻斷下游信號(hào)通路發(fā)揮抗ARDS及后期纖維化改變。