董一峰 狄婷婷 徐樹雷 張子龍 張美 王瑞婷 申興斌

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000;2承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院；3承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

研究證實，β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35是導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)發(fā)生的主要生物因素，且針對AD的研究較多集中在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元病變死亡及氧化應(yīng)激3個方面〔1〕。研究表明寡聚態(tài)可溶性的Aβ25～35可誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)功能發(fā)生損傷、引起神經(jīng)元死亡。作為一類具有代表性的免疫反應(yīng)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)在神經(jīng)損傷及神經(jīng)修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用〔2，3〕。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是一種具有特征性的細(xì)胞表面受體，在特定情況下可引起氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)核因子(NF)-κB的活性，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生。RAGE可以充當(dāng)Aβ受體，同時可與血漿中游離態(tài)Aβ結(jié)合，從而通過血腦屏障轉(zhuǎn)運至腦組織。在AD患者腦內(nèi)，MG上的RAGE水平較健康人群明顯增加，但是其參與AD的機(jī)制尚不明確。BV2與人體內(nèi)MG具有相似的生理功能，因此，本研究擬通過BV2細(xì)胞代替MG，并將BV2與不同濃度梯度的Aβ25～35共孵育，探討Aβ25～35對MG的RAGE/NF-κB通路的影響，為AD的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 BV2購自武漢大學(xué)保藏中心；Aβ25～35購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易公司；細(xì)胞活性檢測試劑盒購自索萊寶公司(北京)； 用于白細(xì)胞介素(IL)-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測的試劑盒購自聯(lián)科生物(北京)；用于Aβ25～35檢測的試劑盒購自酶聯(lián)生物(上海)；兔抗RAGE抗體購自艾博抗公司；兔抗NF-κB抗體購自Antibody Revolution；鼠抗內(nèi)參β-actin抗體購自Affinity；胞核-胞質(zhì)-胞膜蛋白提取試劑盒購自普利萊公司(北京)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 0.025 mg/ml的多聚賴氨酸進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)皿包被，采用高糖DMEM無菌培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)，2 d傳1代，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞開始進(jìn)行實驗。

1.3細(xì)胞活性檢測 收集并重懸BV2細(xì)胞，調(diào)整其濃度，使達(dá)到5×107個/L，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200 μl,(約1×104個細(xì)胞)，同時用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充邊緣孔，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁；次日待BV2細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80%時改用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，按照試驗設(shè)計加入不同濃度梯度Aβ25～35，使其終濃度依次為0、1、5、10、15 μmol/L，分別記為0、1、5、10、15 μmol/L濃度組；同時需設(shè)計調(diào)零孔。各組設(shè)4個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，根據(jù)說明書每孔加入適量噻唑藍(lán)(MTT)。4 h后各孔加入溶解液，搖床反應(yīng)20 min(低速)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測吸光度(A570 nm)，根據(jù)公式細(xì)胞存活比=(實驗組A-調(diào)零孔A)/(0濃度組A-調(diào)零孔A)×100%。

1.4細(xì)胞爬片制備 使用75%濃度的乙醇浸泡潔凈蓋玻片1 d，無菌PBS洗滌至干凈(至少3遍)，蓋玻片擦干后置24孔細(xì)胞板。接種BV2。次日，待細(xì)胞密度達(dá)80%時加入Aβ25～35，每組同樣設(shè)4個復(fù)孔。48 h后，顯微鏡下仔細(xì)觀察并記錄每組BV2的形態(tài)特征。之后4℃條件下吸盡上層培養(yǎng)液，于-80℃保存?zhèn)溆?。此時在培養(yǎng)皿里加入0.5 ml預(yù)冷的多聚甲醛(濃度為4%)，固定10 min，小心吸盡液體，自然晾干5 min，PBS緩沖液洗滌，3 min/次，緩緩吸盡孔內(nèi)液體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5炎癥因子檢測 對TNF-α、IL-1β和Aβ25～35的檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6RAGE及NF-κB蛋白表達(dá) 用PBS液洗滌細(xì)胞爬片3次，3 min/次；加3%過氧化氫(H2O2)10 min，PBS洗滌3次，3 min/次； 加封閉液15 min后吸盡封閉液，不予漂洗；分別加一抗RAGE(1∶50)、NF-κB(1∶100)，4℃冰箱過夜。次日37℃放置20 min，PBS輕洗3次，3 min/次，室溫加山羊抗兔IgG，20 min后PBS輕柔洗滌3次，3 min/次，加入SABC反應(yīng)20 min，PBS洗3次，3 min/次，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察到有棕黃色產(chǎn)生立即用緩慢水流沖洗。蘇木素輕度復(fù)染爬片3 min，70%、80%、90%、95%和100%濃度梯度的乙醇脫水各2～3 min，二甲苯浸泡5 min，中性樹膠封片，晾干待觀察。倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞染色情況。各組隨機(jī)選擇3張爬片，光學(xué)顯微鏡下(×400)每張爬片再隨機(jī)選擇3個不重復(fù)視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件記錄陽性細(xì)胞平均光密度值。

1.7Western印跡(WB)法檢測RAGE及NF-κB蛋白表達(dá) 按照胞核-胞質(zhì)-胞膜蛋白提取劑盒說明書提取各部位總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。每孔蛋白量上樣40 μg，先恒壓80 V，30 min，待樣品至分離膠時，調(diào)整電壓至120 V持續(xù)90 min，蛋白分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，電流調(diào)至150 mA，約需2 h。加入5%脫脂奶粉，置搖床或手動搖擺封閉3 h，緩慢吸盡液體，加入一抗，即RAGE(1∶200)，NF-κB(1∶500)，內(nèi)參β-actin(1∶1 000)，搖床上37℃孵育15 min，4℃冰箱過夜。次日37℃孵育1 h后，TBST緩沖液洗3次，依次用時15 min、15 min、10 min；加入二抗山羊抗兔IgG (1∶5 000)，山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)37℃孵育1.5 h，TBST液洗滌3次，依次用時15 min，10 min，10 min；于暗室進(jìn)行顯影。采用Quantity One分析軟件計算條帶灰度值，目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值即為目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1BV2與Aβ25～35共孵育48 h后細(xì)胞形態(tài)變化 0 μmol/L濃度組BV2胞體較小，類似圓形，折光性較強(qiáng)，含小且致密的核，細(xì)胞質(zhì)較少，長有毛刺樣突起，細(xì)長，高度分支，分支上有較多棘狀，為靜息的MG；1、5 μmol/L濃度組突起開始回縮，偽足伸出，并隨濃度升高呈現(xiàn)吞噬細(xì)胞樣，10、15 μmol/L濃度組細(xì)胞仍呈巨噬細(xì)胞形態(tài)，但數(shù)量開始顯著減少。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)變化(×40)

2.2BV2活性比較 與0、1、5 μmol/L 濃度組比較，10、15 μmol/L 濃度組BV2存活率顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組IL-1β、TNF-α水平比較 與0、1、5 μmol/L濃度組比較，10、15 μmol/L濃度組IL-1β、TNF-α 水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.4各組Aβ25～35減少量比較 與1 μmol/L 濃度組比較，5 μmol/L 濃度組Aβ25～35清除量顯著升高(P<0.05)。與5 μmol/L 濃度組比較，10、15 μmol/L濃度組Aβ25～35清除量顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.5Aβ25～35對BV2細(xì)胞上RAGE、NF-κB表達(dá)水平的影響(ICC法) RAGE的陽性表達(dá)為胞膜著棕黃色，且隨Aβ25～35濃度增大，胞膜著棕黃色面積呈濃度依賴性升高；與5 μmol/L濃度組比較，10、15 μmol/L濃度組胞膜棕黃色面積明顯增加 (P<0.05)。見表1、圖2。

靜息狀態(tài)下，NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)，染色后置光鏡下胞質(zhì)呈黃褐色；激活狀態(tài)下，NF-κB入胞核，胞核呈黃褐色，即為陽性細(xì)胞。0 μmol/L濃度組細(xì)胞質(zhì)為黃褐色，1 μmol/L和5 μmol/L濃度組有較少胞核呈黃褐色；10、15 μmol/L組較多胞核著黃褐色。與5 μmol/L濃度組胞核黃褐色面積比較，10、15 μmol/L組胞核著黃褐色面積顯著增加(P<0.05)。見表1、圖3。

組別BV2(%)IL-1β(pg/ml) TNF-α (pg/ml)Aβ25～35清除量(μmol /L)RAGENF-κB0 μmol/L濃度組100.00±0.013.17±1.0362.78±5.47 0.00±0.000.13±0.040.05±0.021 μmol/L 濃度組97.88±1.984.83±1.1165.44±4.92 0.72±0.010.15±0.020.06±0.015 μmol/L 濃度組82.90±1.7413.50±1.3366.11±4.68 1.53±0.011)2)0.20±0.030.08±0.0110 μmol/L 濃度組47.27±2.921)2)3)54.83±2.911)2)3)82.07±6.101)2)3)0.48±0.011)2)3)0.41±0.011)2)3)0.30±0.011)2)3)15 μmol/L 濃度組42.76±1.961)2)3)59.28±1.451)2)3)102.71±6.291)2)3) 0.22±0.011)2)3)0.50±0.041)2)3)0.39±0.041)2)3)

與0 μmol/L濃度組比較:1)P<0.05;與1 μmol/L濃度組比較:2)P<0.05;與5 μmol/L濃度組比較:3)P<0.05；表2同

圖2 各組RAGE陽性表達(dá)(ICC，×400)

圖3 各組NF-κB陽性表達(dá)(ICC，×400)

2.6WB法檢測Aβ25～35對BV2細(xì)胞上RAGE、NF-κB表達(dá)的影響 RAGE水平隨Aβ25～35濃度增加呈濃度依賴性增加；與5 μmol/L濃度組比較，10 μmol/L、15 μmol/L濃度組RAGE表達(dá)量顯著增加 (P<0.05)。0、1、5 μmol/L濃度組細(xì)胞核中NF-κB表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，10、15 μmol/L濃度組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)量較5 μmol/L濃度組顯著升高(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 WB法檢測各組RAGE、NF-κB表達(dá)

1～5：0、1、5、10、15 μmol/L濃度組圖4 WB法檢測RAGE、NF-κB表達(dá)

3 討 論

RAGE〔4〕普遍表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中〔5〕，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要存在于神經(jīng)元、MG及構(gòu)成血腦屏障(BBB)的內(nèi)皮細(xì)胞中〔6〕。RAGE表達(dá)增加可誘發(fā)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)相關(guān)核因子活性，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病及其他疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Aβ寡聚體可與RAGE 結(jié)合并激活MG〔7〕，且在AD患者腦內(nèi)RAGE可與Aβ產(chǎn)生反應(yīng)，使MG向Aβ斑塊遷移并清除一定量的Aβ，此時MG內(nèi)NF-κB信號通路被激活，IL-1β、TNF-α等炎癥因子進(jìn)行釋放〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞存在M1和M2兩種類型：M1型主要分泌炎癥相關(guān)因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；M2型與M1型相反，主要分泌抗炎因子，負(fù)責(zé)終止炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞正常生理情況下，兩者維持平衡,但在病理情況下，M1型比例增大〔9〕。本研究結(jié)果表明，RAGE表達(dá)量呈Aβ25～35濃度依賴性升高，細(xì)胞形態(tài)亦由0 μmol/L的靜息狀態(tài)變?yōu)?、5μmol/L的激活狀態(tài)(伸出偽足的阿米巴樣)，并隨濃度升高逐漸呈吞噬細(xì)胞樣，炎癥因子IL-1β、TNF-α有增加趨勢，但不顯著，提示此時細(xì)胞可能處于正常的炎癥應(yīng)激狀態(tài)，M1與M2型比例處于平衡狀態(tài)，并對Aβ起到一定的清除作用。但當(dāng)Aβ25～35達(dá)到10 μmol/L的濃度時，BV2細(xì)胞活性顯著降低，對Aβ25～35的清除明顯減少，炎癥因子開始顯著增加，提示本研究中10 μmol/L濃度組細(xì)胞已經(jīng)處于病理狀態(tài)，轉(zhuǎn)化為M1型的比例可能增大，致使炎癥因子增多，細(xì)胞活性降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞對Aβ25～35的清除功能降低。

研究發(fā)現(xiàn)，在病變灶區(qū)域，RAGE可促進(jìn)淀粉樣前體蛋白(APP) 向Aβ的轉(zhuǎn)變〔10〕，如果Aβ過度沉積則會導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生增生及活化現(xiàn)象，同時NF-κB信號被激活，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元損傷甚至死亡。本研究結(jié)果表明，細(xì)胞上清液IL-1β和TNF-α隨Aβ25～35濃度升高呈依賴性增加，但1、5 μmol/L濃度組間差異不大，而10 μmol/L濃度組的炎癥因子即IL-1β和TNF-α水平顯著升高，推測RAGE結(jié)合了大量Aβ25～35，并極有可能激活了細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號。

NF-κB在調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)中非常重要，因其屬于“快速反應(yīng)”的初級轉(zhuǎn)錄因子，在沒有新的蛋白質(zhì)合成時也可以被激活。NF-κB是對有害細(xì)胞刺激的第一反應(yīng)者。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)NF-κB與IκB結(jié)合形成復(fù)合物,此時P50/P65又和結(jié)合態(tài)下的IκB進(jìn)行結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)，因此NF-κB沒有轉(zhuǎn)錄性。但當(dāng)BV2被刺激后，IκB-α亞基被泛素化，并被蛋白酶降解，釋放二聚體形式的NF-κB，此時NF-κB極易易位至細(xì)胞核，與有NF-κB結(jié)合位點的基因結(jié)合，開啟轉(zhuǎn)錄程序。本研究細(xì)胞免疫及Western印跡結(jié)果均表明,1 μmol/L與5 μmol/L濃度組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)差異不明顯，提示核易位還不明顯；但與5 μmol/L組比較，10 μmol/L和15 μmol/L濃度組的核易位現(xiàn)象顯著增強(qiáng)，推測Aβ25～35濃度為后兩者時胞內(nèi)NF-κB信號可能得到激活并介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。鄭重等〔11〕證實NF-κB可被胞外刺激因子TNF-α及IL-1β激活，NF-κB被激活后又能反過來促進(jìn)這兩種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)一步刺激NF-κB。因此形成正反饋調(diào)節(jié)是炎性被放大的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)。另外，根據(jù)本研究結(jié)果，RAGE上調(diào)可能促進(jìn)了炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)量，并激活了NF-κB信號的正反饋調(diào)節(jié)過程，該過程又介導(dǎo)了炎癥因子進(jìn)一步增加，由此形成惡性循環(huán)，最終神經(jīng)毒性逐漸加重，致使BV2開始損傷甚至死亡，使其對Aβ的清除能力下降。但Turillazzi等〔12〕發(fā)現(xiàn)NF-κB被激活還受體內(nèi)另一種負(fù)反饋方式的調(diào)控，即NF-κB入核后，IκB上調(diào)，此時NF-κB可以激活上游信號因子調(diào)節(jié)點，從而使自身活性下降。因此可以認(rèn)為，胞內(nèi)NF-κB激活與否取決于正負(fù)反饋的優(yōu)勢性。因此，本課題組考慮通過調(diào)控Aβ25～35水平激活NF-κB負(fù)反饋信號通路，并同時抑制NF-κB的正反饋調(diào)節(jié)及抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)作為本研究的下一步重點內(nèi)容。

綜上，10 μmol/L濃度的Aβ25～35可致BV2細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，且活性降低，對其清除能力亦下降，這可能與高濃度Aβ25～35引起B(yǎng)V2上RAGE蛋白上調(diào)、NF-κB信號通路被激活有關(guān)。