云燕 吳江 高志勇

(1成都三六三醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610000；2西藏自治區(qū)駐成都辦事處醫(yī)院)

認知功能障礙(POCD)是手術后常見的并發(fā)癥，是指患者手術后引起的神經(jīng)功能、認知功能等發(fā)生不同程度的變化，臨床表現(xiàn)為術后性格變化、學習能力、記憶下降，嚴重者甚至會出現(xiàn)認知功能異常及癡呆等，影響患者術后恢復〔1〕。文獻報道〔2〕，POCD多發(fā)生在老年患者手術后，且臨床對其發(fā)病機制尚不完全知曉，多與患者年齡有關。丙泊酚是手術中常用的麻醉藥物，臨床以靜脈給藥為主，具有麻醉效果好、藥物起效快、無蓄積等特點。但最新研究表明〔3〕，丙泊酚的使用會增加POCD發(fā)生率，但其機制尚未知曉。研究表明〔4〕，丙泊酚臨床使用時能抑制或增強神經(jīng)受體產(chǎn)生的刺激，能激活甘氨酸受體，抑制谷氨酸興奮傳導，且上述信號通路均與人體記憶能力和學習有關。

海馬區(qū)是人體相對重要的區(qū)域，與學習記憶功能等存在緊密聯(lián)系〔5〕。從廣義角度來說，學習是一個多因素過程，是對新生事物、信息獲取和利用的過程，而記憶則是將獲得的信息進行存儲和保存的過程，海馬突觸能塑形長時程增強效應與長時程抑制效應，均為學習、記憶的基礎〔6〕。學習記憶功能的表達則是通過神經(jīng)元之間的突觸實現(xiàn)信息的溝通、傳遞和交流。文獻報道〔7〕，促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)在認知功能障礙的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用。CRF是促激素釋放因子(RF)中的一種，主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦室旁核分泌，當機體處于應激狀態(tài)時，CFR能誘導促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、β-內(nèi)啡肽等因子從垂體前葉釋放，直接作用于腺垂體促腎上腺皮激素分泌細胞，能促進ACTH分泌〔8～10〕。而杏仁核是下丘腦外主要表達CRF的重要部位，包括CRF1和CRF2兩種受體。本文擬探討丙泊酚對老年雄性大鼠海馬生物鐘基因及CRF1R表達的影響及機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 取2015年3月至2017年5月進行實驗的老年雄性SD大鼠60只，隨機數(shù)字法分為空白對照組、小劑量丙泊酚組和大劑量丙泊酚組各20只。體重510～590 g，平均(575.8±10.2)g，大鼠均由醫(yī)院動物實驗中心提供。實驗過程中對老年SD大鼠的飼養(yǎng)、處理均符合《關于善待實驗動物的指導下意見》相關規(guī)則，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，飼養(yǎng)時避免強光、噪音等刺激，日照12 h。所有試驗通過醫(yī)院動物委員會批準同意。

1.2主要儀器和試劑 丙泊酚注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20123138)，Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)，PM-8000 多參數(shù)監(jiān)護儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，手術器械：醫(yī)院提供，超低溫冰箱(中國雪柜實業(yè)有限公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)，離心機(Eppendorf，德國)，事件相關電位測試劑(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.3藥物使用 3組大鼠均在實驗前進行5 d的適應性飼養(yǎng)，并且在實驗開始前進行Morris水迷宮實驗，將由于視力因素或無法形成記憶的大鼠剔除。小劑量丙泊酚組：給予30 mg/kg丙泊酚腹腔注射，待翻正反射消失后給予25 mg/kg丙泊酚進行維持麻醉。大劑量丙泊酚組：給予50 mg/kg丙泊酚腹腔注射，待翻正反射消失后給予25 mg/kg丙泊酚進行維持麻醉。空白對照組：給予30 mg/kg劑量的乳劑。3組藥物注射過程中密切觀察大鼠的血氧、保證大鼠無法體動，麻醉后待大鼠自然蘇醒〔11〕。

1.4Morris水迷宮試驗 (1)原理。Morris水迷宮試驗主要由直徑150 cm、高50 cm圓形水池與一個能調(diào)節(jié)高度、能移動位置平臺構(gòu)成，且水池壁上具有4個等距離的入水電，將水池分為4個象限，并將平臺放置在第三象限。水池內(nèi)放置數(shù)碼相機、監(jiān)視采集卡、計算機等，對大鼠試驗中的游泳軌跡等數(shù)據(jù)進行記錄，待大鼠爬到平臺后計算機完成追蹤，經(jīng)過相關軟件計算大鼠游泳的路徑長度、找到平臺所需時間、游泳速度〔12〕。(2)實驗方法。訓練前大鼠適應性訓練2 min，Morris水迷宮試驗訓練5 d，每天早晨8∶00訓練，每天4次。大鼠在120 s內(nèi)找到平臺，允許其在平臺上進行30 s；在120 s內(nèi)未找到平臺，潛伏期記錄為120 s，人為幫助找到平臺，允許大鼠休息30 s，休息結(jié)束后進行下一次實驗〔13，14〕。

1.5觀察指標 (1)認知功能。采用事件相關電位測試劑及眼動測定3組藥物干預前后認知功能情況，檢查時按摩大鼠四肢，盡可能讓其保持全身肌肉放松，認真記錄電位P300潛伏期、波幅、凝視點數(shù)(NEF)及反應性探索評分(RSS)〔15〕。(2)Morris水迷宮試驗。檢測3組藥物使用前后Morris水迷宮試驗下游泳的路徑長度、找到平臺所需時間、游泳速度。(3)海馬生物鐘基因測定。3組完成Morris水迷宮試驗后0、1、6、24 h，每組取大鼠4只斷頸處死取出全腦放置冰上，充分暴露腦部組織，沿著腦中斷完成皮質(zhì)剝離，將海馬組織迅速分離，利用實時定量聚合酶鏈反應完成海馬生物鐘基因測定〔16，17〕。(4)CRF1R相對表達量。取海馬組織方法同(3)，利用熒光定量聚合酶鏈反應技術測定海馬區(qū)域CRF1R相對表達量，有關操作嚴格遵循試劑盒、儀器步驟完成〔18，19〕。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組治療前后認知功能水平比較 3組藥物干預前電位P300潛伏期和波幅及眼動測定水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；空白對照組干預前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；大劑量丙泊酚組干預后電位P300潛伏期顯著高于小劑量丙泊酚組和空白對照組(P<0.05)，電位P300波幅及眼動NEF、RSS顯著低于小劑量丙泊酚組和空白對照組(P<0.05)，見表1。

組別時間潛伏期(ms)波幅(mV)眼動測定NEF(個)RSS(分)小劑量丙泊酚組干預前314.55±9.214.05±1.7627.30±1.416.15±0.98干預后331.60±25.871)3)3.87±2.661)3)26.30±4.151)3)5.25±1.881)3)大劑量丙泊酚組干預前315.32±9.324.04±1.7327.94±1.236.14±0.95干預后350.21±23.331)2)3)2.58±2.301)2)3)23.10±2.931)2)3)4.10±1.201)2)3)空白對照組干預前315.01±9.324.06±1.7727.29±1.406.13±0.94干預后312.31±9.304.01±1.5926.96±1.326.00±0.91

與空白對照組比較：1)P<0.05；與小劑量丙泊酚組比較：2)P<0.05；與干預前比較：3)P<0.05；同下表

2.23組干預前后Morris水迷宮試驗結(jié)果比較 3組干預前Morris水迷宮試驗游泳路徑、找到平臺時間、游泳速度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；大劑量丙泊酚組干預后游泳路徑長度顯著長于小劑量丙泊酚組和空白對照組(P<0.05)，游泳速度顯著小于小劑量丙泊酚組和空白對照組(P<0.05)；小劑量丙泊酚組干預后游泳路徑長度、找到平臺時間顯著長于空白對照組(P<0.05)，游泳速度顯著小于空白對照組(P<0.05)，見表2。

組別時間游泳路徑長度(cm)找到平臺時間(s)游泳速度(cm/s)小劑量丙泊酚組干預前58.46±4.3620.89±5.350.43±0.12干預后70.93±4.811)3)24.53±5.433)0.39±0.111)3)大劑量丙泊酚組干預前59.06±4.4120.91±5.380.44±0.13干預后87.86±6.941)2)3)30.92±5.891)2)3)0.26±0.081)2)3)空白對照組干預前57.15±4.3321.04±5.410.42±0.11干預后58.75±4.4624.93±5.540.44±0.13

2.33組迷宮試驗后不同時間點海馬生物鐘基因比較 小劑量丙泊酚組與大劑量丙泊酚組0 h海馬生物鐘基因水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但顯著低于空白對照組(P<0.05)；大劑量丙泊酚組干預后1、6、24 h海馬生物鐘基因水平顯著低于小劑量丙泊酚組和空白對照組(P<0.05)，小劑量丙泊酚組顯著低于空白對照組(P<0.05)，見表3。

2.43組迷宮試驗后不同時間點CRF1R相對表達量比較 小劑量丙泊酚組與大劑量丙泊酚組0 h CRF1R相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但顯著低于空白對照組(P<0.05)；大劑量丙泊酚組干預后1、6、24 h CRF1R相對表達量顯著低于小劑量丙泊酚組和空白對照組(P<0.05)，小劑量丙泊酚組顯著低于空白對照組(P<0.05)，見表4。

組別0 h1 h6 h24 h小劑量丙泊酚組0.54±0.251)0.76±0.291)0.89±0.311)0.94±0.351)大劑量丙泊酚組0.55±0.261)0.63±0.281)2)0.71±0.301)2)0.78±0.341)2)空白對照組1.03±0.451.03±0.411.02±0.401.03±0.43

組別0 h1 h6 h24 h小劑量丙泊酚組0.34±0.081)0.38±0.091)0.43±0.091)0.48±0.101)大劑量丙泊酚組0.33±0.091)0.34±0.091)2)0.38±0.091)2)0.42±0.101)2)空白對照組0.53±0.110.52±0.100.50±0.090.54±0.12

3 討 論

POCD是臨床上常見的疾病，多發(fā)生于手術后老年人群中，由于老年患者年齡較大，對于手術耐受性較差，再加上其本身伴有不同程度的POCD，導致術后學習記憶力、定向力、社交能力等發(fā)生變化，影響患者術后恢復，延長住院時間〔20〕。目前，臨床上對于POCD發(fā)病機制尚不完全明確，多與年齡、手術類型、麻醉方式等有關，且患者發(fā)病后如果得不到及時有效的治療，將會演變?yōu)橛谰眯园V呆〔21〕。

丙泊酚是臨床上常用的短效靜脈麻醉藥物，多以靜脈輸注給藥〔22〕。研究表明〔23〕，丙泊酚在臨床使用時容易產(chǎn)生低溫、低血壓、低氧等并發(fā)癥，從而容易增加POCD發(fā)生率。本研究結(jié)果提示，丙泊酚會引起大鼠出現(xiàn)不同程度的POCD，且藥物濃度越高，越嚴重。Morris水迷宮試驗主要包括定位航行實驗與空間探索實驗，定位航行實驗能直接反映大鼠的學習能力；空間探索實驗可以反映大鼠的記憶能力。學習記憶是人體的高級中樞神經(jīng)功能，且學習過程中涉及許多神經(jīng)元及神經(jīng)元之間信息的交流〔24,25〕。研究表明〔26〕，神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)表達水平與學習、記憶存在緊密聯(lián)系，而生物鐘基因約占10.0%的基因表達，能控制機體睡眠、學習記憶、內(nèi)分泌代謝等多種作用。本研究結(jié)果提示，丙泊酚對大鼠海馬生物鐘基因表達水平產(chǎn)生明顯影響，且隨著藥物劑量的增加，其表達水平下降越明顯。

CRF主要由41個氨基酸組成，其表達水平能直接參與機體各系統(tǒng)對刺激產(chǎn)生的反應，且能調(diào)節(jié)機體內(nèi)臟活動及情緒反應。CRF1R屬于G蛋白耦聯(lián)受體，其N端位于膜外，表達水平與大腦皮質(zhì)、下丘腦、杏仁核等感覺結(jié)構(gòu)有關〔27,28〕。本研究結(jié)果提示，丙泊酚對大鼠CRF1R水平會產(chǎn)生明顯影響，但隨著藥物給藥時間的延長，CRF1R水平出現(xiàn)上升趨勢，影響相對較輕，能參與機體疼痛、焦慮情緒的調(diào)控。由于本課題研究時間較短，納入動物數(shù)量相對較少，丙泊酚對老年雄性大鼠海馬生物鐘基因的影響及對CRF1R表達影響的機制均需要進一步研究和探討〔29,30〕。

綜上，丙泊酚會對老年雄性大鼠認知功能產(chǎn)生不同程度的影響且呈濃度依賴性，能影響海馬生物鐘基因及CRF1R表達水平，臨床應用時應采取干預措施，減少對認知功能的影響。