阮凌

(安康學院體育學院，陜西 安康 725000)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病過程包括從簡單脂肪變性脂肪肝與肝細胞損傷，發(fā)展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最后出現(xiàn)肝臟的纖維化和肝硬化〔1〕。Keating等〔2〕研究運動強度和運動量對降低動物NAFLD模型中肝臟和內臟脂肪組織脂肪含量，發(fā)現(xiàn)運動量和運動強度的變化對于減少肝臟脂肪和內臟脂肪無顯著差異。而Zhang等〔3〕和 Tsunoda等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)大強度和中等強度運動均有減少肝臟內三酰甘油(TG)的含量的作用，但大強度運動對于降低體重，體脂，腰圍和血壓較中等強度效果好。同樣，Tsunoda等〔4〕也報道大強度運動有阻止NAFLD發(fā)展為NASH的作用，其效果較小強度和中等強度更加。兩篇研究顯示參與有氧運動的NAFLD患者，肝臟內脂肪明顯減少，但最佳運動強度尚未確定〔2，5〕。大量的研究顯示不同類型的運動對NAFLD的作用〔6〕，總的來說，這些研究建議運動強度相對運動量和運動時間而言，對于運動保護NAFLD起到了更為重要的作用。

有研究顯示耐力運動可以降低久坐的NAFLD人群肝細胞凋亡的標志物，肝細胞凋亡數(shù)量的減少可能與脂代謝能力有關〔7〕。Gon?alves等〔8〕研究顯示高脂飲食誘導的NAFLD大鼠線粒體驅動肝細胞凋亡信號傳導，而耐力性運動可以減少線粒體細胞色素C的釋放，減少細胞膜電位的消耗。本研究旨在探討不同強度運動訓練對NAFLD大鼠脂代謝異常、氧化應激、肝細胞損傷的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象及分組 將購于廣州醫(yī)學院動物中心的50只SD雄性大鼠隨機分為普通安靜對照(CON)組和高脂飲食誘導模型(HFD)組；小強度運動(LIE)組、中等強度運動(MIE)組和遞增強度運動(IIE)組，共計5組，每組10只。

1.2高脂飲食誘導NAFLD大鼠模型的建立 采用高脂飼料(在基礎飼料基礎上添加5%蔗糖、18%豬油、15%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和1%膽固醇)喂養(yǎng)大鼠。喂養(yǎng)16 w后，處死大鼠取肝組織制作蘇木精-伊紅(HE)切片，測試各項生理生化指標，并參考NAFLD病理診斷標準對本模型三酰甘油(TG)，總膽固醇(TC)，低密度蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度蛋白膽固醇(HDL-C)，游離脂肪酸(FFA)及肝功能酶進行評估；同時制作肝組織病理HE切片，并送兩位職業(yè)病理醫(yī)師通過盲法診斷是否符合臨床NAFLD患者診斷標準，建立NAFLD大鼠模型〔9〕。

1.3運動方案 運動負荷的設定是根據大鼠的健康情況，參考Bedford經典跑臺實驗模型來設計。運動組大鼠在適應性跑臺訓練1 w后進行相應強度運動，LIE組：速度15 m/min，60 min/(次·d)；MIE組：速度20 m/min，60 min/(次·d)；IIE組：速度15 m/min(10 min)、速度20 m/min(30 min)，速度27 m/min(20 min)。運動組均5 d/w，共6 w。

1.4血液指標測試 通過全自動生化分析儀檢測血液中的TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA含量。

1.5肝組織病理學切片 取部分肝臟用生理鹽水漂洗數(shù)次后，將肝組織置于10%中性甲醛溶液固定24～48 h，用于制備肝組織病理學切片。鑒于脂肪肝的病理切片在脫蠟過程中肝細胞中的脂肪沉積會被洗脫，故在光鏡下呈空泡狀，可用于鑒定NAFLD病理形態(tài)學特性。

1.6肝臟組織免疫組織化學 將大鼠肝臟石蠟切片，TUNEL法測試肝細胞凋亡，用免疫組織化學法測試陽性細胞表達。淋巴細胞瘤-2基因 (Bcl-2)和Bal-2相關x蛋白(Bax)指標，嚴格按照試劑盒說明進行規(guī)范操作。采用JVC3-CCD攝像頭和Image-Pro Plus圖像處理軟件進行圖像采集與分析。每只大鼠肝組織連續(xù)切片，每隔5張選取一張，共取8張切片，每張片隨機選取6個視野，在400倍光鏡下對5組大鼠肝臟內的凋亡肝細胞、Bcl-2和Bax 的陽性表達計數(shù)。SP定量分析結果以單個視野下陽性細胞光密度值表示。

1.7數(shù)據分析 采用SPSS16.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1不同強度運動對大鼠體重和肝重的影響 HFD組體重較CON組顯著增加(P<0.05)，與HFD組相比，MIE組體重顯著降低(P<0.05) ；但各組肝重差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同強度運動對大鼠體重和肝重的影響

與 CON 組相比：1)P<0.05；與HFD組相比：2)P<0.05

2.2不同強度運動對脂代謝和肝損傷的影響 肝組織進行HE切片顯示CON組肝組織呈現(xiàn)出良好的排列，肝細胞有圓形的中心核，肝小葉沿中心靜脈的輪狀陣列細胞排列。而HFD組肝組織可見脂滴的分布。通過不同強度運動后，肝細胞內脂滴的數(shù)量和體積都減少。HE切片顯示，高脂飲食大鼠出現(xiàn)肝組織脂代謝紊亂，而不同強度運動可改善脂代謝異常(見圖1)。

血脂指標：HFD組較CON組 TG，TC，LDL-C和FFA顯著升高(P<0.01)。運動組與HFD組相比TG、TC、LDL-C和FFA水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。肝功能酶：與CON組相比，HFD組谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)顯著升高(P<0.01)。與HFD組相比，各運動組ALT和AST顯著下降(P<0.01)。見表2。

圖1 各組大鼠肝組織HE切片(×400)

組別TG(mmol/L)TC(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)FFA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)CON組0.45±0.131.36±0.330.26±0.060.41±0.01313.13±23.1551.12±2.2295.68±10.15HFD組1.55±0.211)5.09±0.241)1.89±0.131)0.32±0.07627.33±97.781)247.66±35.261)201.33±21.151)LIE組0.87±0.303)4.17±0.202)1.13±0.112)0.35±0.11569.2±39.393)123.65±69.383)89.71±24.163)MIE組0.80±0.203)4.06±0.102)1.05±0.162)0.37±0.08558.24±68.243)113.85±47.663)91.52±26.383)IIE組0.79±0.183)4.12±0.162)1.05±0.162)0.37±0.09567.65±49.723)106.37±47.663)88.61±35.293)

與CON組相比：1)P<0.01；與 HFD組相比;2)P<0.05，3)P< 0.01

2.3不同強度運動對NAFLD大鼠肝臟氧化指標的影響 與CON組相比，HFD組肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平顯著下降(P<0.01)，丙二醛(MDA)水平顯著升高(P<0.05)。與HFD組相比，各運動組SOD水平均顯著升高(P<0.01)，與IIE組相比，LIE組和MIE組SOD活性顯著升高(P<0.01)；與HFD組比較，各運動組MDA水平均顯著降低(P<0.01) ；與HFD組相比，MIE組過氧化氫酶(CAT)和總抗氧化能力(T-AOC)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與HFD組相比，LIE組、MIE組和IIE組GSH水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，與IIE組相比，MIE組GSH顯著升高(P<0.05)，見表3。

組別SOD(U/mg·prot)MDA(nmol/mg·prot)CAT(U/mg·prot)T-AOC(U/mg·prot)GSH(μmol/mg·prot)CON組179.42 ±34.988.43±3.7713.05±5.525.75±1.55818.35±261.62HFD組37.32±13.862)14.18±3.131)9.72±2.993.62±1.85384.32±80.452)LIE組358.38±191.842)4)6)5.97±2.834)28.26±3.237.01±2.07734.91±344.903)MIE組371.47±151.672)4)6)4.36±1.594)29.61±8.873)10.51±3.164)865.11±205.504)5)IIE組317.28±173.212)4)4.91±2.894)23.81±14.546.05±2.48539.70±282.263)

與CON組相比：1)P< 0.05，2)P<0.01；與HFD組相比：3)P<0.05，4)P<0.01；與IIE組相比：5)P<0.05，6)P<0.01，下表同

2.4不同強度運動對TUNEL法測試凋亡肝細胞及Bax和 Bcl-2的陽性表達的影響 與CON組相比，HFD組TUNEL法測試肝細胞凋亡數(shù)量陽性表達顯著增加(P<0.05)，與HFD組相比，LIE、MIE和IIE組肝細胞凋亡均顯著減少(P<0.05)。 運動6 w后，與CON組相比，HFD組Bcl-2顯著降低(P<0.01)，同時Bax蛋白表達顯著增加 (P<0.01)；與HFD組相比，LIE和MIE組Bax蛋白表達均顯著降低 (P<0.01)，LIE 組和MIE組Bcl-2蛋白表達顯著增加(P<0.05，P<0.01)，見圖2、圖3、表4。

圖2 TUNEL法測定凋亡肝細胞的陽性表達(×400)

圖3 免疫組化法測試 Bax和 Bcl-2蛋白表達(×400)

表4 TUNEL法測試凋亡肝細胞及Bax和 Bcl-2的陽性表達

3 討 論

NAFLD發(fā)展的病理機制主要與脂代謝紊亂、炎癥反應、氧化應激和肝細胞凋亡密切相關〔10，11〕。 運動是美國肝病研究協(xié)會〔12〕推薦治療NAFLD的主要方式，盡管運動強度和其機制尚未確定〔2，5〕。

Matthew Morris等〔13〕研究中采用高脂飲食誘導的NAFLD大鼠模型，通過高脂飲食喂養(yǎng)16 w大鼠，出現(xiàn)血脂異常，高血糖，肝臟損傷標志物表達升高及脂代謝紊亂導致的肝臟組織學變化等一系列癥狀。由于正常肝細胞不能分解過量的FFA，特別是長鏈飽和脂肪酸，過量的長鏈脂肪酸轉化為TG，從而誘導的肝細胞內細胞器發(fā)生氧化應激，特別是線粒體和內質網，最終激活了肝細胞凋亡的途徑〔14，15〕。通過大量的研究表明氧化應激，脂質過氧化和肝細胞損傷在NAFLD的發(fā)病機制中起著重要作用，特別是在高脂飲食誘導的NAFLD大鼠模型中。

Fisher等〔16〕研究還未發(fā)現(xiàn)HDL-C的改善，但是通過6 w不同強度的訓練我們可以看到TC，TG，LDL-C和FFA濃度降低，表明不同強度的運動均可降血脂，防止肝臟進一步損傷。目前有研究表明〔8〕，中等強度運動對脂代謝紊亂有一定改善效果，但很少有不同強度的運動之間的對比研究。最近的一些研究表明，高強度間歇訓練和持續(xù)的適度訓練對NAFLD的影響，結果顯示這兩種訓練對降低NAFLD大鼠的FFA、TG、ALT和AST有同樣的效果〔6，16，17〕。另外還有研究顯示：中、小強度運動和大強度運動對改善TC，TG，ALT和AST具有相同的作用〔18〕。本研究結果也提示，不同運動強度對降低血脂，改善肝功能酶和防止肝損傷方面同樣有效。

氧化應激與脂質過氧化已被證明會損害肝臟中的核苷酸和蛋白質合成，從而導致NAFLD大鼠肝細胞凋亡，肝組織炎癥和纖維化。運動提高機體抗氧化能力，對改善NAFLD而言是一種重要的方式。本研究結果表明中等強度的運動改善抗氧化能力效果最好，運動對NAFLD大鼠抗氧化的作用，是依賴運動強度的變化。矛盾的是，NAFLD大鼠肝臟中氧化應激標志物MDA的水平降低似乎與運動強度無關，由于在本研究中缺乏ROS和其他氧化應激指標的測試，抗氧化作用對強度依賴性的關系無法進一步證實。Oh等〔18〕提出通過中到大強度的運動，受試者肝臟中脂肪含量和氧化應激水平的有效降低，這可能有助于改善NAFLD?？偟膩碚f，這些研究結果提供了NAFLD依賴運動強度的變化，來提高抗氧化能力的直接證據。

肝細胞凋亡的發(fā)生主要受死亡受體信號轉導途徑，線粒體信號通路和ER信號通路的調控。最近研究顯示運動上調NAFLD大鼠抗細胞凋亡Bcl-2的表達和Bcl-2/Bax的比例，下調促細胞凋亡的Bax表達，在預防非酒精脂肪肝肝纖維化甚至肝硬化的進程中起到重要作用〔19〕。

研究報道中等強度運動 (開始強度15 m/min 逐漸增加到25 m/min，60 min/d ) 和體育鍛煉降低了凋亡信號 (Bax和Bax/Bcl-2)，但只有中等強度運動增加 Bcl-2含量〔8〕。