張玉領 李春梅 陳培 薛白

(江蘇護理職業(yè)學院，江蘇 淮安 223005)

自噬是機體清除衰老細胞，維持細胞自身穩(wěn)態(tài)的重要途徑。細胞依靠自噬實現對細胞內成分的循環(huán)利用，維持正常的生命活動〔1〕。研究發(fā)現，自噬對腫瘤細胞的影響是一把雙刃劍，自噬在腫瘤發(fā)展的不同階段能夠抑制腫瘤產生和轉移，是促進腫瘤細胞凋亡的重要途徑；而另一方面，自噬能在不利環(huán)境中提高腫瘤細胞對應激的耐受能力，維持其生存，完成免疫逃逸〔2，3〕。本研究通過體外轉染自噬基因BECN1，觀察其對MG803胃癌細胞自噬活性、生長和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 人BECN1(NM-003766)plVX-IRES-Puro-3xFlag 細胞轉染質粒購自長沙優(yōu)寶生物科技有限公司，MG803胃癌細胞株購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司。主要儀器：Bio-Rad蛋白電泳及轉膜系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)、倒置顯微鏡(奧林巴斯，USA)、Millipore Direct-Q3 實驗室純水/超純水一體化系統(tǒng)、Eppendorf 低溫離心機、電熱式壓力蒸汽消毒器、PYC-16 CO2培養(yǎng)箱。

1.2細胞培養(yǎng) 將凍存的MG803細胞從液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴鍋內溶解復蘇。培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每3～4 d細胞對數生長期見融合度達70%左右時，將瓶內的舊培養(yǎng)液倒去，加入37℃預熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)，蕩洗3次，加入37℃預熱的0.25%胰蛋白酶1.5 ml，使細胞充分消化后，加入培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打至細胞完全脫壁，分瓶傳代。

1.3細胞轉染 將5 μl BECN1模擬物稀釋于100 μl無血清培養(yǎng)基中，將5 μl脂質體稀釋于100 μl無血清培養(yǎng)基中，而后將BECN1模擬物加入脂質體中，輕輕吹打混合后室溫孵育20 min，形成BECN1-脂質體復合物。取對數生長期MG803胃癌細胞，胰酶消化并計數。將消化好的細胞接種至6孔板，每孔接種(2～5)×105個細胞培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達70%～80%時，將BECN1-脂質體復合物加入6孔板，每孔200 μl，37℃培養(yǎng)。

1.4細胞劃痕實驗 在6孔板中加入約5×105個細胞，具體數量因細胞種類不同而不同，接種原則為過夜后融合率達到100%。細胞培養(yǎng)過夜后用槍頭在6孔板垂直劃痕，槍頭垂直，不能傾斜。PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。而后放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，于劃痕后0 h、24 h和48 h分別取樣，拍照。

1.5Western印跡法 取對數生長期細胞，于培養(yǎng)瓶中提取蛋白，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取蛋白上樣量為50 μg，樣品經過十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，濕轉法將膠上蛋白印跡轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉2 h，加入微管相關蛋白1輕鏈(LC)3B抗體4℃冰箱孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后加入二抗，以相應的濃度孵育2 h，經化學發(fā)光后，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Image J分析目標帶的灰度值。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1過表達BECN1對MG803胃癌細胞增殖能力的影響 與對照組相比，在轉染后24 h、48 h和72 h，BECN1能夠顯著抑制MG803胃癌細胞的增殖能力(P<0.05)。見表1。

組別0 h24 h48 h72 h對照組148 000±11 700302 000±21 100388 000±24 600430 000±31 300BECN1轉染組150 000±10 400221 000±15 3001)285 000±19 2001)310 000±22 9001)

與對照組相比：1)P<0.05

2.2BECN1轉染對細胞侵襲的影響 分別于劃痕后0 h、24 h和48 h觀察MG803胃癌細胞株劃痕恢復情況，在劃痕后48 h，過表達BECN1的MG803胃癌細胞劃痕恢復略差于對照組，而24 h兩組無明顯差異，見圖1。

2.3BECN1轉染對MG803胃癌細胞自噬活性的影響 過表達BECN1基因的MG803胃癌細胞LC3B表達量(28 679±2 812)顯著高于對照組(6 454±579)。見圖2。

圖1 細胞劃痕實驗結果(×40)

圖2 BECN1轉染對MG803胃癌細胞LC3B表達的影響

3 討 論

自噬是機體淘汰衰老細胞、清理病原體的有效途徑〔4〕，自噬通過調控癌癥啟動因素，如組織損傷、慢性炎癥、DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性等，最終導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔5，6〕。

自噬功能缺陷的細胞由于線粒體受損及大量異樣蛋白的聚集會產生大量的活性氧(ROS)，從而引起 DNA 突變及染色體異常，激活癌基因，導致腫瘤細胞形成〔7〕。BECN1 是一種抑癌基因，通過調控細胞自噬調節(jié)細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)〔8〕。在多種惡性腫瘤細胞內，由于BECN1編碼區(qū)及內含子的突變，使其無法形成自噬核心復合物〔9〕，BECN1的表達缺失與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后等密切相關〔10～12〕。研究表明，40%～75%的人類乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中存在BECN1基因缺失，證明BECN1是一種單基因缺失的候選抑癌基因〔13〕，BECN1等位基因缺失的小鼠易發(fā)生肝腫瘤、淋巴瘤和乳腺癌〔14〕。逃避程序性死亡(PCD)是惡性腫瘤細胞的特征之一，而自噬的啟動是引發(fā)衰老和損傷細胞過程的敲門磚，其表達異常直接影響細胞的生物行為。Konishi等〔15〕研究發(fā)現BECN1基因敲除的細胞其吞噬功能嚴重受到影響；而BECN1下調則明顯減弱了細胞自噬活性功能〔16〕。因此，BECN1基因在腫瘤細胞自噬的發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義。

LC3是酵母自噬相關基因(ATG8)的同源基因，其表達產物 LC3A 隨著自噬過程被啟動，當細胞發(fā)生自噬時，LC3A轉化為LC3B，并定位在自噬體膜上，LC3B 表達量與細胞自噬程度呈正比，是判斷細胞自噬活性的特異性分子標志物〔17〕。本研究表明BECN1基因表達的增加能夠顯著提高MG803胃癌細胞自噬活性。綜上，在胃癌細胞中，LC3B表達降低，細胞自噬活性受到抑制。過表達自噬相關基因BECN1能夠顯著促進LC3B的表達，提高細胞自噬活性。提示自噬相關基因BECN1與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。