姚文琴 余躍生 王定瑜 黨榮敏 鄭文 宋偉

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558003)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是嚴(yán)重影響人類健康的難治病，以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥性的自身免疫性疾病，其特征癥狀為對(duì)稱性、周圍性多個(gè)關(guān)節(jié)慢性炎性病變，臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作過(guò)程。透骨香是杜鵑花科植物滇白珠Gaultherialeu-cocarpaBl.var.crenulata ( Kurz ) T.Z.Hsu 的莖葉，性熱，味辛、辣，屬熱藥，入冷經(jīng)，其根、梗具活血祛瘀、祛風(fēng)除濕作用，可治風(fēng)寒濕痹，筋骨疼痛〔1〕等。化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、香豆精類、有機(jī)酸、黃酮、木脂素苷類，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒作用，多用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷和濕疹等方面的治療〔2〕，臨床常見(jiàn)含透骨香的復(fù)方成藥有“滇白珠糖漿”“復(fù)方伸筋膠囊”“痛風(fēng)靈”等，為苗族民間治療類風(fēng)濕病的習(xí)用藥材，療效突出〔3〕。本研究旨在探討透骨香醇提液對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 SD雄性大鼠(SPF級(jí))60只，體重250～270 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。透骨香購(gòu)自貴州省黔南州都勻市藥材市場(chǎng)，經(jīng)黔南民族醫(yī)專藥學(xué)系鑒定為杜鵑花植物滇白珠 Gaultherialeu-cocarpa Bl.var.crenulata ( Kurz ) 。藥物提取采用醇提法，分別取一定體積配制成濃度(相當(dāng)于原藥材)為4，2，1 g/ml儲(chǔ)備液備用。雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號(hào)(20170501)，人日用量為1.0～1.5 mg/(kg·d)，按人60 kg體重折算為大鼠等效劑量。

1.1.2試劑與儀器 卡介苗(批號(hào)201309a017-1)，上海生物制品研究所；CII(批號(hào)：112D055)為sigma公司產(chǎn)品；大鼠白細(xì)胞介素(IL)-17、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒〔酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)〕北京索萊寶科技有限公司提供，批號(hào)：201406；酶標(biāo)儀(mindrady MR-96A)。

1.2方法

1.2.1Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型的建立 根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度、范圍及關(guān)節(jié)腫大變形情況，采用五級(jí)評(píng)分法進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，觀察關(guān)節(jié)腫脹受累情況。造模及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)〔4，5〕。

1.2.2動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、雷公藤多苷組、透骨香高、中、低劑量組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予等量蒸餾水灌胃；透骨香治療組分別給予4、2、1 g/kg透骨香醇提物灌胃；雷公藤多苷組給予雷公藤多苷溶液6 mg/(kg·d)灌胃。以上各組給藥體積為20 ml/kg，連續(xù)給藥 21 d。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1臟器指數(shù) 末次給藥2 h后稱重處死大鼠，取出肝、脾及腎臟等臟器，用電子天平稱質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體重× 100%。

1.3.2血清 IL-17、VEGF、IL-1β、TNF-α水平檢測(cè) 各組大鼠連續(xù)灌胃21 d，禁食24 h，于第21天灌胃2 h后股動(dòng)脈取血2 000 r/min離心15 min取上清液，-20℃下保存待測(cè)。IL-17、VGEF、IL-1β和TNF-α采用ELISA法按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.3病理檢查 剪取踝關(guān)節(jié)，去掉皮膚組織，迅速置10%甲醛固定脫鈣液中，取固定好的踝關(guān)節(jié)先后用70%、 80%和90%乙醇脫水，再依次將組織塊進(jìn)行透明處理后放入已溶的石蠟內(nèi)浸蠟包埋、切片，放入溫箱內(nèi)干燥待染，將烘干好的石蠟切片進(jìn)行脫蠟(3缸二甲苯)水洗后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE)，中性塑膠封片鏡檢。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組臟器指數(shù)比較 與模型對(duì)照組比較，雷公藤多苷組肝臟脂數(shù)明顯降低(P<0.01)，透骨香中劑量組肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組體重及臟器指數(shù)比較

與模型對(duì)照組比較：1)P<0.01

2.2各組血清 IL-17、VEGF、IL-1β、TNF-α水平比較 與模型對(duì)照組比較,不同劑量透骨香治療組可顯著降低血清中IL-17、IL-1β、TNF-α水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴；對(duì)VGEF的影響則以中、高劑量組為主。見(jiàn)表2。

2.3病理檢查結(jié)果 正常對(duì)照組：關(guān)節(jié)周圍組織結(jié)構(gòu)正常，滑膜細(xì)胞、軟骨及骨組織中未見(jiàn)炎癥性病變。模型對(duì)照組：滑膜上皮增生，部分上皮壞死脫落，上皮下及纖維脂肪中可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，并見(jiàn)脂肪壞死、肉芽腫形成。雷公藤多苷組：滑膜上皮增生，滑膜細(xì)胞及周圍纖維脂肪組織中淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞明顯減少，肉芽腫數(shù)量也明顯減少，仍可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞。透骨香低劑量組：鏡下病變同模型對(duì)照組。透骨香中劑量組：滑膜組織及周圍纖維脂肪仍可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，肉芽腫形成。與低劑量組比較，以上炎癥細(xì)胞及肉芽腫病變略為減少。透骨香高劑量組：滑膜上皮增生，局灶可見(jiàn)壞死脫落，可見(jiàn)散在浸潤(rùn)之中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞，仍見(jiàn)肉芽腫病變，數(shù)量較之前明顯減少。見(jiàn)圖1。

組別IL-17VEGFIL-1βTNF-α正常對(duì)照組804.56±261.92961.95±304.0934.92±11.91497.27±74.25模型對(duì)照組914.69±372.751 082.84±189.0639.79±5.24549.09±67.48雷公藤多苷組783.04±313.24878.36±215.4731.19±6.92436.03±116.13透骨香低劑量組538.66±126.462)967.11±262.0932.15±4.662)351.88±74.911)透骨香中劑量組471.32±257.542)698.61±38.571)28.92±3.781)269.78±49.671)透骨香高劑量組257.15±79.621)609.09±122.031)30.79±5.311)201.50±133.051)

與模型對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

圖1 踝關(guān)節(jié)組織病理檢查結(jié)果(HE，×200)

3 討 論

RA是目前公認(rèn)的難治性疾病，往往會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙且病因復(fù)雜，可能與遺傳、感染、免疫功能異常等有關(guān)，其中由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子在疾病調(diào)控中起重要作用，關(guān)節(jié)破壞和滑膜炎癥發(fā)生是由相互依賴的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的。程佳等〔6〕研究表明在RA患者血清及關(guān)節(jié)滑膜液中，IL-17 表達(dá)明顯升高。IL-17是輔助性T細(xì)胞17分泌產(chǎn)生的一種重要的前致炎細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的致炎作用，可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，引起骨侵蝕。同時(shí)促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生的IL-1β、TNF-α能夠和 IL-17 協(xié)同激活 RA 的成纖維滑膜細(xì)胞，使前炎癥因子表達(dá)增多，誘導(dǎo)軟骨和成纖維細(xì)胞合成與分泌膠原酶、前列腺素等炎性介質(zhì)，介導(dǎo)滑膜炎性反應(yīng)和軟骨破壞。VEGF是直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高度特異性，可誘導(dǎo)毛細(xì)血管增生 、促進(jìn)新血管生成等重要的生物學(xué)功能。樊有龍等〔 7,8〕從RA患者的血清、關(guān)節(jié)液及滑膜組織中可檢出高水平的 VEGF，并發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF受體表達(dá) VEGF介導(dǎo)的關(guān)節(jié)損傷是RA發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分。綜上，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者測(cè)定IL-17、IL-1β、TNF-α、VEGF水平變化對(duì)診斷病情活動(dòng)或緩解癥狀有重要的臨床意義，可作為臨床判斷治療效果的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

本研究結(jié)果說(shuō)明透骨香醇提液對(duì)RA有治療效果。分析其機(jī)制可能與透骨香的活性成分水楊酸甲酯糖苷等〔9〕具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、 活血化瘀和消腫止痛作用〔10〕，其作用機(jī)制與下調(diào)IL-17、VGEF、IL-1β和TNF-α等炎癥介質(zhì)表達(dá)有關(guān)。通過(guò)上述研究為透骨香的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，且不良反應(yīng)較少，患者耐受性較好。