韋伊爾 田艷 李仕成 鄒瑩 冼樂(lè)武

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1重癥醫(yī)學(xué)科， 廣東 廣州 510095；2中西醫(yī)結(jié)合科)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是近年來(lái)世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一〔1〕，在已證實(shí)有效的綜合治療方法中化療占重要地位，但癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是化療面臨的最大挑戰(zhàn)，其中分化型胚胎軟骨發(fā)育基因(DEC1)主要通過(guò)識(shí)別靶基因的E-box 結(jié)構(gòu)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用〔2，3〕，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞分化中起重要作用；細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1 作為細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，其過(guò)高表達(dá)往往加快腫瘤的增殖和惡性演進(jìn)。參慈膠囊由名方仙魚(yú)湯化裁而來(lái)，前期的臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)對(duì)NSCLC具有較好的臨床療效〔4，5〕。本文通過(guò)觀察參慈膠囊聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠A549肺癌組織DEC1及cyclinD1表達(dá)的影響，證實(shí)其配合化療具有提高療效的作用，并研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 人肺腺癌細(xì)胞A549由上海艾研生物科技有限公司提供。Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，氯仿、異丙醇購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，75%乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，瓊脂糖粉末購(gòu)自BIOWEST公司，50×TAE緩沖液購(gòu)自BIODEE公司，溴化乙錠(EB)溶液購(gòu)自Solarbio公司，DL2000 DNA Marker、6倍上樣緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自TakaRa公司，RQ1 RNase-Free試劑盒購(gòu)自PROMEGA公司。DEC1基因上游引物：5′-TGTGGGAGAGAAAGACAAGGAGA-3′，下游引物：5′-TTTCCTCCATTGTAGCAGACTCC-3′，擴(kuò)增片段為201 bp；以GAPDH為內(nèi)參引物，上游引物：5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′，下游引物：5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTC-3′，擴(kuò)增片段為157 bp，參照Gene Bank，由上海生工生物工程有限公司合成。裸鼠選取4～6周齡BALB/C鼠，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF 級(jí))，共66只，雌雄各半，體重(20±2)g。參慈膠囊組成：仙鶴草15 g、魚(yú)腥草30 g、貓爪草30 g 、山海螺30 g、黨參25 g、田七片10 g、山慈菇10 g、浙貝15 g、守宮5 g、天冬15 g、炙甘草5 g，由三九制藥集團(tuán)提供免煎顆粒，由本院藥房提供。順鉑江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。兔抗人cyclinD1單克隆抗體、鏈菌素親生物素-過(guò)氧化物酶(SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與造模〔6〕細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)在體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液中(內(nèi)加青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2濃度、飽和濕度及37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)如圖1。在無(wú)菌條件下，用1×107/ml濃度，每次0.2 ml的人肺腺癌細(xì)胞A549懸液注射至66只BALB/C裸鼠雙側(cè)前腋窩皮下，1個(gè)月后瘤塊長(zhǎng)成約黃豆大小，至此荷瘤鼠制成。按照體積大小為(0.125±0.012)cm3(長(zhǎng)×寬×高×π/6)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，剔除瘤塊未生成、過(guò)大及過(guò)小的荷瘤裸鼠后，共選用32只，備用。

圖1 肺腺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)

1.3分組與干預(yù) 選取合格的32只荷瘤裸鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、參慈膠囊組、參慈膠囊+順鉑組，并記錄入組體積，每組8只。對(duì)照組：予以0.2 ml生理鹽水灌胃、0.1 ml生理鹽水腹腔注射；參慈膠囊組：中藥免煎顆粒按照2.2 g/20.0 g小鼠的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)配灌胃液0.2 ml灌胃、0.1 ml生理鹽水腹腔注射；順鉑組：予以0.2 ml生理鹽水灌胃、順鉑按照每天0.02 mg/20.00 g的標(biāo)準(zhǔn)稀釋至0.1 ml行腹腔注射；參慈膠囊+順鉑組：中藥免煎顆粒按照2.2 g/20.0 g小鼠的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)配灌胃液0.2 ml灌胃、順鉑按照每天0.02 mg/20.00 g的標(biāo)準(zhǔn)稀釋至0.1 ml行腹腔注射。連續(xù)干預(yù)3 w后測(cè)量體積后，脫頸處死，分離腫瘤組織，用于指標(biāo)檢測(cè)，并記錄終末體積。

1.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組cyclinD1的表達(dá)情況 采用SP法，選取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，乙二胺四乙酸(EDTA)高溫抗原修復(fù)，一部分切片行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色；免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；DAB顯色，顯微鏡下觀察。磷酸鹽緩沖液(PBS)做空白對(duì)照。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：總評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分×染色評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分>80%計(jì)4分，51%～80%計(jì)3分，10%～50%計(jì)2分，<10%計(jì)1分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分；染色強(qiáng)度：無(wú)著色細(xì)胞計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分〔7，8〕。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)各組肺癌組織DEC1 mRNA的表達(dá) 腫瘤組織取材后，一部分加Trizol置于凍存管中液氮保存，至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。使用Trizol法用氯仿和異丙醇結(jié)合乙醇分離提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量，隨后按照RQ1 RNase-Free試劑盒說(shuō)明進(jìn)行去DNA處理，接著按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。按照RT-PCR流程，使用美國(guó)ABI PE7000全自動(dòng)熒光定量PCR儀對(duì)4組實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行定量操作。待反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算最終循環(huán)結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線。計(jì)算每一樣品和其內(nèi)參對(duì)照的相對(duì)含量，以每微升cDNA所含的基因拷貝數(shù)與每微升cDNA所含GAPDH的拷貝數(shù)的比值進(jìn)行定量比較〔9〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腫瘤體積比較 4組干預(yù)前體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)后均明顯增大(P<0.05)；對(duì)照組與參慈膠囊組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.963，P=0.352)，順鉑組、參慈膠囊+順鉑組明顯小于對(duì)照組(t=9.354、11.894，均P=0.000)、參慈膠囊組(t=8.215、10.694，均P=0.000)；參慈膠囊+順鉑組明顯小于順鉑組(t=2.893，P=0.012)。見(jiàn)表1。

表1 各組肺癌組織體積比較

與干預(yù)前比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05；與順鉑組比較：3)P<0.05

2.2各級(jí)瘤細(xì)胞病理切片HE染色 對(duì)照組瘤細(xì)胞排列密集，大小不等，細(xì)胞核較大，可見(jiàn)病理性核分裂象，血管較為密集，血供豐富；參慈膠囊組瘤細(xì)胞排列略密集，大小不等，可見(jiàn)病理性核分裂象，血管略密集，血供相對(duì)豐富；順鉑組可見(jiàn)壞死腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞間隙較大，部分癌細(xì)胞呈活躍狀，細(xì)胞間隙略大；參慈膠囊+順鉑組可見(jiàn)大片壞死的腫瘤細(xì)胞及核固縮、核碎裂的細(xì)胞，細(xì)胞間隙較大，見(jiàn)圖2。

圖2 各組瘤細(xì)胞病理切片HE染色(×40)

2.3各組cyclinD1表達(dá)免疫組化評(píng)分比較 參慈膠囊組肺癌組織cyclinD1表達(dá)情況的免疫組化評(píng)分與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.084，P=0.934)，順鉑組、參慈膠囊+順鉑組明顯小于對(duì)照組(t=4.603、6.548，均P=0.000)、參慈膠囊組(t=4.243、5.974，P=0.010、0.000)，參慈膠囊+順鉑組明顯小于順鉑組(t=2.252，P=0.041)，見(jiàn)表2。

2.4各組瘤細(xì)胞免疫組化cyolinD1表達(dá)情況 對(duì)照組顯色較深，cyclinD1表達(dá)較多；參慈膠囊組顯色略淺，cyclinD1表達(dá)較對(duì)照組略少；順鉑組可見(jiàn)細(xì)胞核濃縮或碎裂，顯色較淺，cyclinD1表達(dá)較少；參慈膠囊+順鉑組細(xì)胞核碎裂較多，較順鉑組顯示淺，cyclinD1表達(dá)少。見(jiàn)圖3。

2.5各組DEC1 mRNA表達(dá)比較 對(duì)照組與參慈膠囊組DEC1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.00±0.00 vs 1.07±0.11;t=-1.751,P=0.102)。順鉑組、參慈膠囊+順鉑組(1.71±0.13，2.23±0.14)均明顯高于對(duì)照組(t=-14.754、-20.045，均P=0.000)、參慈膠囊組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.378、-18.122，均P=0.000)。參慈膠囊+順鉑組明顯高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.467，P=0.000)。

圖3 各組瘤細(xì)胞免疫組化cyclinD1表達(dá)情況(×40)

表2 各組cyclinD1表達(dá)情況的免疫組化評(píng)分分)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與順鉑組比較：2)P<0.05

3 討 論

參慈膠囊方中黨參健脾益氣，培土生金，輔助正氣，天冬養(yǎng)陰潤(rùn)肺，清火生津，魚(yú)腥草、甘草清肺解毒，化痰清肺，仙鶴草補(bǔ)虛消積，又能止血，對(duì)肺癌咯血具有良好的療效，山慈菇、浙貝母，貓爪草，山海螺善于化痰散結(jié)，田七祛瘀，守宮解毒抗癌，全方具有健脾清肺祛瘀、解毒化痰散結(jié)的功效〔10～12〕。

腫瘤體積大小能夠直觀顯示腫瘤治療的情況，本研究結(jié)果說(shuō)明，單用參慈膠囊無(wú)明顯療效；順鉑化療的療效比較穩(wěn)定；參慈膠囊配合順鉑化療具有提高療效的作用。

cyclinD1是G1期細(xì)胞周期素，正常情況下，cyclinD1蛋白只是在G1期呈一過(guò)性表達(dá)，任何原因引起cyclinD1持續(xù)高表達(dá)都將使細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤，其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)使用參慈膠囊難以有效控制腫瘤；但參慈膠囊配合順鉑化療具有提高療效的作用。

DEC1為bHLH類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔15〕。DEC1在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與肺癌細(xì)胞分化程度和增殖能力有關(guān)，與cyclinD1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果說(shuō)明，單獨(dú)使用參慈膠囊難以有效控制腫瘤。且參慈膠囊聯(lián)合順鉑化療能夠提高療效，可能通過(guò)DEC1表達(dá)下調(diào)，并負(fù)相關(guān)上調(diào)cyclinD1表達(dá)有關(guān)，顯現(xiàn)出對(duì)腫瘤的控制作用。

總之，參慈膠囊聯(lián)合順鉑化療能夠有效減小腫瘤體積，降低cyclinD1的表達(dá)及提高DEC1 mRNA表達(dá)，其作用明顯優(yōu)于順鉑化療。