劉雪環(huán)， 胡沙沙， 王 程， 欒 曉， 郭菲菲， 孫向榮， 徐 珞△

(1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系， 山東 青島 266021； 2青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科， 山東 青島 266555)

腸缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷是創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過程，其不僅引起腸屏障功能障礙，還可導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官損傷、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1]。目前關(guān)于腸I/R損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，但活性氧(reactive oxygen species, ROS)和炎癥因子的產(chǎn)生被認(rèn)為是導(dǎo)致腸I/R損傷的重要機(jī)制。褐藻糖膠(fucoidan)是一種從海帶中提取純化的天然復(fù)合多糖，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[2]。研究表明，褐藻糖膠可改變腸道菌群，減輕環(huán)磷酰胺引起的腸黏膜損傷[3]，且褐藻糖膠對心肌、腎、肝以及腦缺血再灌注損傷具有臟器保護(hù)作用[4-7],但褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷是否具有腸保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究在構(gòu)建大鼠腸缺血再灌注損傷模型基礎(chǔ)上，初步探討了褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷的影響及潛在機(jī)制，為開發(fā)褐藻糖膠用于臨床缺血再灌注損傷性疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)試劑

褐藻糖膠，純度99%，購自Sigma；二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和D-乳酸(D-lactic acid, D-LA)ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒和髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)試劑盒購自南京建成生物工程公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)ELISA試劑盒均購自欣博盛生物科技公司;抗Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2及β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及腸缺血再灌注模型的構(gòu)建 30只(SPF級，8周齡)成年雄性Wistar大鼠(購于山東省青島市藥品檢驗(yàn)所)，體重250～300 g，隨機(jī)分為3組(n=10)：假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組和褐藻糖膠(Fucoidan+I/R)組。Fucoidan+I/R組于缺血再灌注前7 d持續(xù)腹腔注射濃度為20 g/L的褐藻糖膠(160 mg/kg)[7]直至處死；sham組及I/R組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水作為對照。所有大鼠術(shù)前禁食(可自由飲水)12 h，稱重，10%水合氯醛(30 mL/kg)腹腔麻醉。將大鼠仰臥固定于鼠板，劍突下腹正中做長約3 cm切口，暴露腸系膜上動脈。Sham組僅分離腸系膜上動脈，并不夾閉。分離腸系膜上動脈后，I/R組和Fucoidan+I/R組均用無創(chuàng)血管夾夾閉腸系膜上動脈1 h，松夾后，持續(xù)再灌注2 h，制備腸缺血再灌注模型。

2.2樣本的采集

2.2.1血標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠經(jīng)腹主動脈取血4 mL，室溫靜置30 min，離心(4 ℃，1 000×g)10 min，取上層血清，-80 ℃冰箱保存，以備DAO、D-LA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平檢測。

2.2.2組織標(biāo)本 取距盲腸約5 cm的回腸組織5～6 cm，迅速放入備好的冰生理鹽水進(jìn)行漂洗，無菌濾紙吸干水分。剪下1～2 cm腸段放入4%甲醛溶液固定后用石蠟包埋，用于后續(xù)小腸組織形態(tài)觀察。另剪下1～2 cm腸段刮取腸上皮黏膜，制備10%組織勻漿，離心(4 ℃，1 000×g)10 min，吸取上清液，存于-80 ℃冰箱，用于組織MDA和GSH含量及SOD和MPO活性的檢測。剩余腸段，存于-80 ℃冰箱，用于組織Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白水平的檢測。

2.3腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察 回腸組織常規(guī)石蠟包埋，制作厚約5 μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并采用Chiu’s 6級評分法對腸黏膜損傷程度進(jìn)行評價[8]。0分：正常小腸絨毛上皮；1分：絨毛尖端處上皮下間隙增大，毛細(xì)血管有淤血現(xiàn)象；2分：上皮下間隙擴(kuò)張，伴隨上皮層同固有層的中度分離；3分：絨毛兩側(cè)上皮層大量地同固有層分離，部分絨毛頂端破損；4分：絨毛破損伴隨固有層毛細(xì)血管暴露，固有層中性粒細(xì)胞增多；5分：固有層破壞、內(nèi)皮下出血和潰瘍。

2.4血清DAO、D-LA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清DAO、D-LA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平，所有指標(biāo)的檢測應(yīng)嚴(yán)格按照ELISA說明書進(jìn)行操作。

2.5腸組織MDA、GSH含量和SOD、MPO活性測定 采用硫代巴比妥酸法測定腸組織MDA的含量；采用二硫代雙硝基苯甲酸比色法測定腸組織GSH的含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定腸組織SOD活性；采用依賴過氧化氫的鄰聯(lián)二茵香胺氧化還原反應(yīng)法測定腸組織MPO的活性。所有指標(biāo)的檢測嚴(yán)格遵守試劑盒說明書指引。

2.6Western blot法檢測腸組織Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白的水平 取凍存回腸組織，剪碎，加入裂解液冰上30 min，離心(4 ℃，16 000×g)5 min，提取上清液并蛋白定量。進(jìn)行SDS-PACE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，然后加入封閉液室溫孵育1 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min,加Ⅱ抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，運(yùn)用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對每個條帶進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)變化的影響

光鏡下可見，sham組大鼠腸黏膜組織絨毛排列整齊，未見有明顯損傷；但I(xiàn)/R組腸黏膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛組織發(fā)生嚴(yán)重脫落并伴有腺體的嚴(yán)重受損；而Fucoidan+I/R組腸黏膜組織損傷較輕，絨毛呈輕中度水腫，絨毛頂端變鈍，表面的杯狀細(xì)胞清晰可見，偶見崩解，見圖1A。Chiu’s評分結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R組腸黏膜組織損傷明顯加重(P<0.05)；與I/R組相比，F(xiàn)ucoidan+I/R組大鼠腸黏膜組織損傷顯著減輕(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1.HE staining was used to observe the effect of intraperitoneal injection of fucoidan on the morphology of intestinal mucosa in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. A: histopathological pictures; B: Chiu’s score. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖1 HE染色觀察腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)變化的影響

2 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠血清DAO和D-LA水平的影響

與sham組相比，I/R組血清DAO和D-LA水平顯著升高(P<0.05)，而褐藻糖膠預(yù)處理能顯著降低腸缺血再灌后血清DAO和D-LA水平，但仍高于sham組(P<0.05)，見表1。

3 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸黏膜MDA、GSH含量和SOD活性的影響

與sham相比，I/R組大鼠腸黏膜組織中MDA含量顯著增加(P<0.05)；與I/R組相比，褐藻糖膠預(yù)處理可顯著降低腸黏膜中MDA含量(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)。與sham組相比，I/R組及Fucoidan+I/R組腸組織GSH含量和SOD活性均顯著降低(P<0.05)，但Fucoidan+I/R組腸組織GSH含量和SOD活性顯著高于I/R組(P<0.05)，見圖2。

表1 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠血清DAO和D-LA水平的影響

Table 1.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on serum DAO and D-LA levels in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury (Mean±SD.n=10)

GroupDAO (103 U/L)D-LA (mg/L)Sham1.43±0.170.57±0.09I/R4.59±0.41?2.46±0.25?Fucoidan+I/R2.58±0.43?#1.36±0.12?#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

Figure 2.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on MDA, GSH content and SOD activity in intestinal mucosa of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖2 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸黏膜MDA和GSH含量及SOD活性的影響

4 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸黏膜組織MPO活性的影響

MPO作為中性粒細(xì)胞浸潤的指標(biāo)，其檢測結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R組大鼠腸黏膜組織MPO活性顯著增加(P<0.05)；與I/R組相比,褐藻糖膠預(yù)處理能顯著降低腸黏膜組織MPO活性(P<0.05)，但仍顯著高于sham組(P<0.05)，見圖3。

5 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

與sham組相比，I/R組的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯升高(P<0.05)，褐藻糖膠預(yù)處理能顯著抑制I/R誘導(dǎo)的血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的升高(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)，見表2。

Figure 3.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on MPO activity in intestinal mucosa of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖3 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸黏膜組織MPO活性的影響

表2 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平的影響

Table 2.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on serum levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury (ng/L. Mean±SD.n=10)

GroupTNF-αIL-6IL-1βSham10.65±1.608.72±1.495.04±0.41I/R55.77±4.36?49.14±2.99?38.70±2.87?Fucoidan+I/R29.81±2.33?#21.75±2.08?#16.01±1.34?#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

6 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸組織Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與sham組相比，I/R組的Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，褐藻糖膠預(yù)處理能明顯降低缺血再灌注后腸組織Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，升高Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)，但Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)仍高于sham組，Bcl-2蛋白表達(dá)仍低于sham組(P<0.05)，見圖4。

討 論

腸缺血再灌注損傷是臨床過程中的常見事件，常繼發(fā)于腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病。I/R誘導(dǎo)的腸黏膜損傷，可使腸黏膜通透性增加，繼而引發(fā)內(nèi)毒素血癥、腸內(nèi)細(xì)菌移位和大量炎癥因子的釋放，隨之可誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合癥和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生。此外，氧自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)也是引起腸缺血再灌注損傷的重要病理生理機(jī)制[9]。

Figure 4.Effects of intraperitoneal injection of fucoidan on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖4 腹腔注射褐藻糖膠對腸缺血再灌注損傷大鼠腸組織Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

DAO是具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，D-LA是腸道內(nèi)固有細(xì)菌代謝的產(chǎn)物之一，其活性變化可以反映腸黏膜通透性強(qiáng)弱，進(jìn)而顯示出腸屏障損傷程度[10]。有文獻(xiàn)報道，褐藻糖膠可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞屏障損傷[11]，最新研究顯示，在乳腺癌大鼠模型中，褐藻糖膠可通過促進(jìn)TJ蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腸屏障功能[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠血清DAO和D-LA水平明顯升高，而Fucoidan+I/R組大鼠血清DAO及D-LA水平與I/R組相比顯著降低。此外，與I/R組相比，F(xiàn)ucoidan+I/R組大鼠腸黏膜組織損傷顯著減輕，Chiu’s評分降低，提示褐藻糖膠可能具有腸黏膜細(xì)胞保護(hù)作用，這可能與減弱腸黏膜通透性相關(guān)。

腸缺血再灌注后大量氧自由基的釋放是導(dǎo)致腸缺血再灌注損傷的重要因素之一。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量與自由基引起的細(xì)胞損傷程度呈正比[12-13]。GSH和SOD均為清除氧自由基的重要酶，其水平的高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。 研究顯示，褐藻糖膠可抑制肝I/R損傷誘導(dǎo)的肝組織MDA水平[6]，褐藻糖膠可糾正腦I/R損傷誘導(dǎo)的MDA和SOD異常水平[7]。本研究觀察到，與I/R組相比，F(xiàn)ucoidan+I/R組大鼠腸黏膜組織MDA含量顯著降低，但GSH含量及SOD活性顯著升高，提示褐藻糖膠能有效抑制腸缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)，在腸缺血再灌注損傷中發(fā)揮著潛在抗氧化作用。

MPO是嗜中性粒細(xì)胞顆粒的特征成分，可反映中性粒細(xì)胞浸潤和激活的程度，進(jìn)而反映炎癥損傷程度[14]。文獻(xiàn)報道，在心臟和腎缺血再灌注損傷中，褐藻糖膠能顯著抑制心臟和腎臟的MPO活性，還可抑制炎癥細(xì)胞浸潤、白細(xì)胞滾動和白細(xì)胞遷移[5]。本研究結(jié)果顯示，褐藻糖膠預(yù)處理的腸缺血再灌注大鼠，其腸組織MPO活性顯著降低，提示褐藻糖膠可能通過抗炎作用減輕腸組織缺血再灌注損傷。

炎性細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生是腸缺血再灌注損傷發(fā)展的重要病理機(jī)制，TNF-α、IL-6和IL-1β是重要的促炎細(xì)胞因子，被認(rèn)為是人體細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子標(biāo)志物[15]。近期研究表明[16]，在腸道炎癥時，低分子量的褐藻糖膠可通過抑制IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生增強(qiáng)腸黏膜屏障。有文獻(xiàn)報道[17]，低分子量的褐藻糖膠可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的活性。本研究結(jié)果顯示，I/R組大鼠血清TNF-α、IL-6以及IL-1β的水平顯著升高；褐藻糖膠預(yù)處理，可顯著降低I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，提示在腸缺血再灌注損傷中，褐藻糖膠可能通過抗炎效應(yīng)發(fā)揮腸黏膜細(xì)胞保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡途徑分外源性(死亡受體)、內(nèi)源性(線粒體)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡3個途徑?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax是細(xì)胞內(nèi)源性線粒體通路的重要調(diào)節(jié)因子；caspase-3是凋亡途徑中重要的凋亡執(zhí)行因子，其水平的高低可反映細(xì)胞凋亡的程度[18]。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷引起小腸絨毛上皮細(xì)胞死亡的主要形式[19]。Gao等[20]研究顯示，褐藻糖膠可通過降低Bax/Bcl-2比率或降低caspase-3表達(dá)，進(jìn)而抑制過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。本研究表明，與缺血再灌注組相比，褐藻糖膠組大鼠腸組織中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，Bax及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)則顯著表達(dá)降低，提示褐藻糖膠在腸缺血再灌注損傷中具有抗細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，褐藻糖膠可減輕腸缺血再灌注誘導(dǎo)的小腸組織損傷，其機(jī)制可能與減少中性粒細(xì)胞浸潤、炎癥因子釋放，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、增強(qiáng)抗氧化酶活性以及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。