陳興宇， 羅銀河△， 王孟清， 陳瑩瑩， 李 艷， 黃凱玲， 孫 樂， 丁 伊， 孫軒龍

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南 長沙 410208； 2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙 410007)

哮喘的特征是氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑。反復(fù)氣道上皮損傷，黏液腺和杯狀細(xì)胞增生，上皮下廣泛膠原沉積和纖維化，平滑肌肥大和增生及細(xì)胞外基質(zhì)紊亂等病理生理改變，最終導(dǎo)致持續(xù)的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑，發(fā)生哮喘[1]。雖有大量的研究探討導(dǎo)致氣道重塑的病理生理機(jī)制，但有效地逆轉(zhuǎn)氣道重塑仍缺少方法。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2信號通路是廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，參與多種細(xì)胞異常增殖與分化的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[2]。已有研究報道，ERK1/2信號通路與復(fù)發(fā)性哮喘氣道重塑發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，使用卵清蛋白構(gòu)建的過敏性哮喘模型小鼠的肺組織中ERK1/2蛋白磷酸化顯著增加[3]，白細(xì)胞介素33(interleukin-33,IL-33)可以通過激活ERK1/2信號通路促進(jìn)哮喘小鼠的氣道重塑[4]。然而，ERK1/2信號通路在哮喘中的具體作用機(jī)制仍有待闡明。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)誘發(fā)哮喘建立大鼠哮喘模型，觀察咳喘寧(Kechuangning, KCN)對肺組織中金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloprotei-nase-1, TIMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的變化以及ERK1/2蛋白和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，從而探討咳喘寧改善哮喘氣道重塑的治療機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物

健康Wistar大鼠70只，SPF級，雌性，28～35 d，體重 90～110 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號為SYXK(京)2016-0006。正常飼養(yǎng)適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

咳喘寧口服液制備：由炙麻黃、杏仁、桃仁、大青葉、生石膏、細(xì)茶和甘草等中藥組成，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，每瓶100 mL，含生藥70 g。RSV Long株及人Hep-2細(xì)胞由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部病毒學(xué)研究所提供。PD98059購自Selleck;雞卵清蛋白(ovalbumin, OVA)購自Solarbio;Masson染色液購自Solarbio; 中性樹膠購自BurBgene；蘇木素-伊紅染色液購自Auragene；PAS染色液購自Solarbio；MMP-9、TIMP-1、ERK1/2及p-ERK1/2兔抗多克隆抗體均購自Abcam。

3 主要方法

3.1RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠模型的建立及鑒定 參考文獻(xiàn)[5]并適當(dāng)改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)第1和2天，分別鼻腔滴入1.0×106PFU RSV，每只50 μL，同時腹腔注射1%OVA 0.25 mL以致敏，正常對照組給予等容積Hep-2細(xì)胞滴鼻，同時腹腔注射等容積生理鹽水。自實(shí)驗(yàn)第9天起，給予1%OVA 霧化以激發(fā)哮喘，正常對照組給予等容積生理鹽水霧化，每次 30 min，隔天1次，連續(xù)2周。霧化結(jié)束后見哮喘模型組大鼠出現(xiàn)明顯點(diǎn)頭樣喘息，腹肌抽搐，甚至站立不穩(wěn)而撲倒時即為哮喘急性發(fā)作，并從正常對照組和造模后大鼠中分別隨機(jī)抽取5只進(jìn)行氣道反應(yīng)性測定，觀測到造模后大鼠在乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)的激發(fā)下氣道反應(yīng)性顯著高于正常對照組(P<0.01)，見圖1A，提示造模成功。

3.2氣道反應(yīng)性測定 予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，待大鼠四肢松弛后，固定于木板上，切開頸部皮膚暴露頸靜脈及氣管，用靜脈留置針行頸靜脈穿刺并固定，V行剪開氣管，予深靜脈穿刺針行氣管插管，接動物呼吸機(jī)。設(shè)置呼吸頻率為每分鐘75次，吸呼比1∶1，潮氣量8 mL/kg。通過頸靜脈先后間歇推注生理鹽水0.5 mL以及6.25～50 mg/L濃度梯度的Ach 0.5 mL，每次間隔約1 min，以計算機(jī)動物肺功能分析軟件檢測基礎(chǔ)吸氣相氣道阻力(Re)和用藥后的Re，以Re超過基礎(chǔ)值的2倍以上為停止Ach推注的標(biāo)準(zhǔn)，以Re的變化代表氣道反應(yīng)性。

3.3分組及給藥 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常(normal)組、哮喘模型(model)組、咳喘寧低劑量(low dose of KCN)組、咳喘寧中劑量(middle dose of KCN)組、咳喘寧高劑量(high dose of KCN)組和PD98059組，每組 10 只?？却瓕幍?、中、高劑量組按臨床量效關(guān)系(200 g大鼠與70 kg的成人按體表面積換算的等效劑量比值0.018)并參照以往研究結(jié)果[6]，計算出各藥物組的臨床等效劑量，分別灌胃咳喘寧口服液0.33 mL/kg，3 mL/kg和10 mL/kg，并腹腔注射生理鹽水10 mL/kg；PD98059組腹腔注射PD98059 3 mg/kg，并灌胃等容積生理鹽水；正常組及模型組灌胃并腹腔注射等容積生理鹽水，每次激發(fā)前1 h給藥，每日1次，連續(xù)14 d。

3.4HE染色、Masson染色和PAS染色 取出大鼠肺組織后，氣管內(nèi)注射 4%多聚甲醛1 mL， 然后將全肺浸入 4%多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，切片，分別進(jìn)行HE染色，PAS染色和Masson染色以觀察肺部大體病理學(xué)改變、支氣管上皮細(xì)胞下膠原沉積以及杯狀細(xì)胞分泌黏液的情況。Masson 染色結(jié)果統(tǒng)計采用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)定量分析，其陽性區(qū)域?yàn)樗{(lán)色。PAS 染色的結(jié)果統(tǒng)計使用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)定量分析紅染陽性區(qū)域，計算氣道黏液儲備指數(shù)和杯狀細(xì)胞化生指數(shù)。

3.5免疫組織化學(xué)染色法 石蠟切片常規(guī)脫蠟后水化，于3% H2O2溶液中封閉15 min，PBS浸洗2次，每次各5 min；高壓熱修復(fù)抗原，PBS浸洗2次，每次各5 min，滴加非免疫正常山羊血清100 μL，室溫孵育60 min后，移液槍吸去封閉液，分別滴加抗MMP-9和TIMP-1 Ⅰ抗，4℃孵育過夜，使用PBST充分浸洗5次，每次各5 min，HRP標(biāo)記聚合物，室溫孵育30 min，PBST充分浸洗5次，每次各5 min，DAB顯色30 s，蒸餾水稍洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。

3.6Western blot 取肺組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組取50 μg的總蛋白，按 1∶4 加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴中加熱5 min，預(yù)制膠孔中加入樣本，然后進(jìn)行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉 1 h，分別加入ERK1/2及p-ERK1/2 Ⅰ抗和內(nèi)參照β-actin抗體孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫與膜孵育1 h，TBST 洗滌3次，每次 10 min。凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，掃描后用Quantity One 灰度分析軟件進(jìn)行光密度計算，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照β-actin 灰度值的比值表示相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 16.0 軟件，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，任意2組均數(shù)的比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，不齊者用Dunett’s T3檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 咳喘寧對哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性的影響

經(jīng)各濃度梯度乙酰膽堿激發(fā)后，模型組大鼠氣道反應(yīng)性顯著高于正常組(P<0.01)，咳喘寧及PD98059的干預(yù)處理可以顯著降低哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性，肺阻力(AL)顯著降低(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1.A: The airway responsiveness was measured to determine whether the asthma rat model were successfully constructed.n=5. B: effects of different concentrations of acetylcholine on airway response in rats. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

圖1 各組大鼠在不同濃度乙酰膽堿激發(fā)下的氣道反應(yīng)性變化

2 咳喘寧對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)的影響

HE 染色結(jié)果可見，正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)和氣道黏膜上皮完整，支氣管管腔規(guī)則，支氣管、血管周圍未見明顯炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠肺組織有氣道壁顯著增厚，肺毛細(xì)血管水腫，支氣管黏膜皺襞增多、斷裂，氣管內(nèi)和血管周圍可見炎性細(xì)胞廣泛浸潤，以嗜酸性細(xì)胞增多為主;經(jīng)咳喘寧治療后，大鼠肺組織病變明顯減輕，支氣管和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，氣道黏膜充血水腫減輕;PD98059組肺組織損傷減輕，但改善不如咳喘寧組明顯,見圖2。

Figure 2.The HE staining results of lung tissue in different groups. The nucleus was stained with hematoxylin, and the color was bright blue. The cytoplasm was stained with eosin, and the color ranged from pink to dark red.

圖2 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

3 PAS染色和Masson染色

PAS染色顯示，分泌黏液的杯狀上皮細(xì)胞被染為紅色，正常組大鼠肺組織幾乎看不到 PAS 染色陽性細(xì)胞，模型組 PAS 染色陽性細(xì)胞顯著增加，通過使用Image-Pro Plus 6.0計算氣道黏液儲備指數(shù)以評價氣道重塑程度，模型組氣道黏液儲備指數(shù)較正常組顯著增加(P<0.01)，而咳喘寧低、中、高劑量組以及PD98059組較模型組大鼠氣道黏液儲備指數(shù)顯著減少(P<0.01)，見圖3、5A。Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺臟氣道上皮下僅有少量淡藍(lán)色膠原沉積，而模型組可見大量深藍(lán)色膠原沉積，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，咳喘寧低、中、高劑量組大鼠氣道上皮下膠原沉積較模型組顯著減少，以咳喘寧高劑量組效果最佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5B。

Figure 3.The PAS staining results of lung tissue in different groups. Cells or tissues containing glycogen, neutrophil and various glycoproteins were stained red; cells or tissues containing neutral mucin and acid mucin could be stained in varying degrees from blue to purple.

圖3 各組大鼠肺組織PAS染色結(jié)果

Figure 4.The Masson staining results of lung tissue in different groups. The collagen fibers in the tissue were stained blue.

圖4 各組大鼠肺組織Masson染色結(jié)果

Figure 5.Quantitative analysis results of the PAS staining (A) and the Masson staining (B) in different groups. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖5 各組大鼠PAS和Masson染色評分結(jié)果

4 咳喘寧對哮喘大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響

采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)變化，可見正常大鼠氣道黏膜上皮幾乎無MMP-9和TIMP-1表達(dá)；模型組大鼠MMP-9廣泛表達(dá)于氣道的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間質(zhì)中，TIMP-1主要表達(dá)在上皮細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表達(dá)量均顯著多于正常組(P<0.01)；咳喘寧中、高劑量組及PD98059組MMP-9和TIMP-1表達(dá)量較模型組顯著減少(P<0.01)，以咳喘寧高劑量組效果最佳，見圖6～8。

5 咳喘寧對哮喘大鼠肺組織中ERK1/2及p- ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

使用Western blot法檢測大鼠肺組織中ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表達(dá)，模型組ERK1/2、p-ERK1/2蛋白含量顯著高于正常組(P<0.01)，但p-ERK1/2/ERK1/2比值無顯著差異(P>0.05);咳喘寧高劑量組及PD98059組肺組織中p-ERK1/2及p-ERK1/2/ERK1/2比值較模型組顯著降低(P<0.01)，且兩組間作用無顯著性差異(P>0.05)，見圖9。

討 論

哮喘是一種常見的呼吸道疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率?？却瓕幨怯珊现嗅t(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院王孟清教授根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)典名方五虎湯改良而成，具有清肺化痰，止咳平喘的功效，我們先前研究已證實(shí)，咳喘寧可以大部組抑RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)展為哮喘，影響Th1/Th2類細(xì)胞因子平衡而防治哮喘[6]。本研究進(jìn)一步證明，咳喘寧可抑制RSV誘發(fā)哮喘大鼠肺組織ERK1/2的磷酸化，降低肺組織中MMP-9及TIMP-1表達(dá)，延緩氣道重塑，降低大鼠氣道高反應(yīng)性而治療哮喘。

Figure 6.Immunohistochemical staining results of MMP-9 in lung tissue of each group

圖6 各組大鼠肺組織MMP-9免疫組化結(jié)果

Figure 7.Immunohistochemical staining results of TIMP-1 in lung tissue of each group.

圖7 各組大鼠肺組織TIMP-1免疫組化結(jié)果

Figure 8.The expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of rats in different groups. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖8 各組大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)的結(jié)果

Figure 9.The protein expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in lung tissue of rats in different groups.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖9 各組大鼠肺組織中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)的結(jié)果

MMP-9及TIMP-1是引起炎癥及氣道重塑的關(guān)鍵因子，MMP-9由上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，通過上調(diào)基質(zhì)相關(guān)生長因子如TGF-β1等釋放以及誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，加速膠原沉積，促進(jìn)新的血管及上皮形成導(dǎo)致氣道纖維化，參與氣道重塑[7]。而TIMP-1可使細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，并使其降解產(chǎn)物在黏膜下層聚集，引起氣道壁增厚，這兩者失衡促使哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)MMP-9及TIMP-1的水平可能是抑制哮喘氣道重塑的有效方法[8]。研究表明，五虎湯前身麻杏石甘湯可抑制MMP-9和TIMP-1表達(dá)，改善哮喘癥狀[9]。本研究也觀察到，經(jīng)咳喘寧治療后，RSV誘發(fā)哮喘大鼠肺組織中MMP-9及TIMP-1表達(dá)均下降，提示咳喘寧可能通過調(diào)節(jié)肺組織中MMP-9及TIMP-1水平而治療哮喘氣道重塑，同時，本研究進(jìn)一步證明了這種作用可能與其抑制肺組織ERK1/2磷酸化有關(guān)。

ERK為脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡等多種過程中具有重要作用，參與多種細(xì)胞異常增殖與分化的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[10]。ERK有多種亞型，在細(xì)胞中主要為ERK1和ERK2(ERK1/2)2種亞型分布，ERK1/2 被激活成 p-ERK1/2 后能介導(dǎo)多種生長因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，PD98059是ERK1/2上游分子分裂活化抑制劑的有效抑制劑，它可以通過抑制MEK1/2的活性從而抑制ERK1/2的磷酸化[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)血管活性腸肽可通過ERK1/2信號傳導(dǎo)途徑抑制哮喘小鼠模型中的氣道平滑肌細(xì)胞增殖，使用PD98059能夠抑制平滑肌細(xì)胞中組織型TIMP-1的表達(dá)[12]。研究表明，p-ERK1/2和MMP-9的表達(dá)水平與支氣管壁厚度顯著正相關(guān)，在哮喘小鼠中ERK1/2信號通路的激活促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，通過誘導(dǎo)p-ERK1/2 /MMP-9通路促進(jìn)哮喘患者的氣道重塑[13]。這些研究都顯示了ERK1/2信號通路在調(diào)節(jié)MMP-9及TIMP-1的水平以及在哮喘氣道重塑發(fā)生機(jī)制中的重要性，但國內(nèi)在這方面的研究報道尚少見。在本研究中，RSV誘發(fā)哮喘大鼠肺組織中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白含量顯著高于正常組，PD98059治療顯著改善大鼠哮喘癥狀，降低大鼠肺組織TIMP-1和MMP-9的含量，與之前研究相一致，同時本研究觀察到咳喘寧治療雖沒有顯著降低ERK1/2蛋白水平的作用，但咳喘寧高劑量組p-ERK1/2的含量及p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著降低，且與PD98059組相比較，兩者作用無顯著差異，這提示咳喘寧高劑量灌胃處理可以顯著抑制ERK1/2 的磷酸化；咳喘寧低、中劑量組對于p-ERK1/2表達(dá)無顯著差異，說明咳喘寧抑制ERK1/2 的磷酸化的作用需要達(dá)到一定濃度。

綜上所述，本項(xiàng)工作顯示了咳喘寧可有效降低RSV誘發(fā)大鼠肺組織中MMP-9 及 TIMP-1水平，減少氣道膠原沉積與杯狀上皮過度化生，改善哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性，這種作用可能與其抑制p-ERK1/2蛋白的表達(dá)有關(guān)，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。