郭青榜， 馮文化， 張 釗

(南陽市中心醫(yī)院特需二科， 河南 南陽 473000)

囊性纖維化跨膜轉導調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種cAMP激活的ATP門控氯離子通道，是ATP結合蛋白家族成員[1]。CFTR基因突變可導致囊性纖維化的產(chǎn)生，主要表現(xiàn)為呼吸道和胃腸道等上皮細胞氯通道功能異常[2]。除了廣泛分布于胃、腸和呼吸道等上皮細胞外，在哺乳動物的心肌細胞和平滑肌細胞也發(fā)現(xiàn)CFTR的豐富表達[3-4]，同時CFTR還參與到一系列心血管疾病的發(fā)病過程中，比如血管平滑肌的收縮[5]和心肌細胞動作電位的形成[6]。CFTR基因敲除小鼠可觀察到心臟功能的異常[5, 7]。隨著CFTR在心血管疾病中研究的深入，它的一些新功能被進一步揭示，例如最近在CFTR基因敲除小鼠研究中發(fā)現(xiàn)CFTR參與了缺血預處理對缺血再灌注損傷心肌的保護作用，這可能與其抑制心肌細胞凋亡的作用相關[8]；同時，囊性纖維化患者較常人也更容易發(fā)生心肌細胞死亡[9]。但是，這些變化是由于CFTR的廣泛缺失所造成還是直接由心肌細胞中CFTR的功能缺陷所導致卻依然未知。因此，CFTR在心血管疾病中的病理生理作用仍有待全面闡述。

為此，本文利用專業(yè)缺氧工作站使大鼠心肌 H9c2細胞暴露于1% 氧含量環(huán)境中建立低氧模型，探究CFTR在低氧環(huán)境中對心肌細胞凋亡的直接影響。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

大鼠心肌 H9c2細胞購自中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco；Lipofectamine 3000、MTT試劑、BCA試劑盒、抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自江蘇碧云天公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物公司；Hoechst 33342、RNA定量試劑盒和ReverseAid 逆轉錄酶購自Thermo Fisher Scientific；CFTR過表達質(zhì)粒購自GeneCopoeia；CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172購自Selleck； DMSO和dNTP Mix購自Sigma-Aldrich；ROS檢測試劑盒購自Abcam；TRIzol試劑盒購自Life Technologies；SuperReal PreMix試劑盒購自Tiangen；抗CFTR抗體購自Santa Cruz。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)和低氧細胞模型的建立 大鼠心肌H9c2細胞生長在有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，置于5% CO2、95%相對濕度、37 ℃恒溫密閉式培養(yǎng)箱(Thermo 3111)內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)期細胞，在專業(yè)缺氧工作站(Coy LABORATORY PRODUCTS)中給予低氧(1% O2、5% CO2、其余以氮氣填充)處理12 h后，建立低氧細胞模型。

2.2細胞轉染實驗 大鼠心肌H9c2細胞以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合至80%左右時，更換無血清培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 3000說明書進行轉染CFTR過表達質(zhì)粒。取100 μL無血清 Opti-MEM培養(yǎng)基加入6 μL Lipofectamine 3000，混勻，室溫孵育5 min；取100 μL無血清 Opti-MEM培養(yǎng)基中加入4 μg CFTR過表達質(zhì)粒，之后加入4 μL Lipofectamine 3000，充分混勻，室溫孵育5 min；把二者混合，室溫孵育20 min后，把混合物加入到細胞，與細胞共孵育6 h，去除培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。此細胞經(jīng)檢測轉染效率后，用于后續(xù)實驗。

2.3細胞CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172的處理 20 μmol/L CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172處理大鼠心肌H9c2細胞12 h，此細胞用于后續(xù)實驗。

2.4MTT實驗檢測細胞活力 細胞處于對數(shù)生長期時，每孔5×103個細胞接種于96孔板中，經(jīng)相應處理后，每孔中加入10 μL MTT溶液(5 g/L，溶劑為PBS緩沖液)，反應4 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO溶液，振蕩混勻后，利用多功能酶標儀(Synergy H1)在570 nm處檢測各孔吸光度(A)值。

2.5Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡 以每孔2×104個細胞接種于24孔板中，給予相應處理后，在細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mg/L的Hoechst 33342溶液染色，30 min后用PBS洗3次，每次5 min,以除去殘余染料。染色結束后用熒光顯微鏡(Olympus BX53)進行拍照以觀察細胞凋亡情況。

2.6Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡 以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，給予相應處理后，按照Annexin V-FITC /PI細胞凋亡試劑盒說明書操作步驟，室溫1 000 ×g離心5 min收集細胞，PBS重懸細胞2次，然后每個樣品中加入500 μL 試劑盒自帶的結合緩沖液用來制備細胞懸液。加入 5 μL Annexin V-FITC試劑室溫避光孵育10 min，再加入5 μL碘化丙啶試劑室溫避光孵育10 min，流式細胞儀(Beckman Cytomics FC 500)讀取激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度，并采用FlowJo V.7.6.2軟件分析其凋亡率。

2.7DCF-DA探針檢測細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成 以每孔1×104個細胞接種于48孔板中分組處理，利用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞。400×g離心5 min后棄去上清，之后根據(jù)ROS檢測試劑盒說明書進行細胞內(nèi)ROS檢測。DCF染色30 min結束后，用熒光顯微鏡(Olympus BX53)進行細胞內(nèi)ROS檢測和數(shù)據(jù)分析。

2.8總RNA提取及RT-qPCR檢測CFTR 的mRNA表達水平 以每孔5×105個細胞接種于6孔板中給予相應處理后，去除培養(yǎng)基，使用PBS洗細胞3次。然后按照TRIzol試劑盒說明書操作提取細胞總RNA。提取的總RNA以DEPC水溶解后，按照RNA定量試劑盒說明書使用Qubit 2.0熒光計進行RNA濃度定量。以1 μg總RNA進行逆轉錄反應(總體系為20 μL)，具體步驟如下：每個樣品管中加入1 μg總RNA和50 μmol/L(1 μL)Oligo dT混合均勻后，加DEPC水至13 μL混勻后65 ℃反應5 min，隨后冷卻至4 ℃，然后分別依次加入4 μL 反應緩沖液，2 μL dNTP Mix和1 μL ReverseAid 逆轉錄酶，充分混勻，42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min逆轉錄為cDNA。逆轉錄完成后按照SuperReal PreMix試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR(反應體系為10 μL)。CFTR正向引物為5’-ATGTGAAGCACGGAGACTGA-3’，CFTR反向引物為5’-CTAGGGTCCAGAGACACACCC-3’；Actb正向引物為5’-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3’，Actb反向引物為5’-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3’。設置參數(shù)：95 ℃ 15 min； 95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，最后緩慢升溫至95 ℃。以Actb為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析CFTR的mRNA相對水平。

2.9Western blot檢測相關蛋白表達 以每孔5×105個細胞接種于6孔板中給予相應處理后，去除培養(yǎng)基，使用PBS洗細胞3次，加入蛋白裂解液，萃取總蛋白?？偟鞍滓訠CA試劑盒定量后，進行SDS-PAGE。依次經(jīng)過電泳、電轉、封膜后，加入稀釋比例為1∶1 000的CFTR抗體和稀釋比例為1∶5 000的β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加入稀釋比例為1∶2 000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)，室溫孵育1 h，洗膜3次，暗室ECL化學發(fā)光曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參照，Image Pro Plus軟件掃描CFTR灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 6 軟件進行分析。實驗結果表述為均數(shù)±標準差(mean±SD)。對于兩組資料比較采用雙側t檢驗，多組資料中數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法后行SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 低氧抑制H9c2細胞CFTR的表達

相對于正常氧培養(yǎng)組，H9c2細胞在給予低氧(1%氧氣含量)處理12 h后，CFTR mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05),見圖1。

Figure 1.Hypoxia treatment induced significantly down-regulated mRNA and protein level of CFTR in H9c2 cardiomyocytes. A: the mRNA level of CFTR was examined by RT-qPCR; B: the protein level of CFTR was examined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormoxia group.

圖1 低氧處理促使心肌H9c2細胞CFTR的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)

2 低氧處理抑制心肌H9c2細胞的活力并促使其凋亡

MTT結果顯示,相對于正常氧培養(yǎng)組，心肌 H9c2細胞在給予低氧(1%氧氣含量)處理12 h后，細胞活力顯著下降(P<0.05),見圖2A；Hoechst 33342染色結果顯示:正常氧培養(yǎng)組細胞核著色后呈現(xiàn)為圓形，且為均一藍色;低氧組細胞核DNA因固縮而被致密濃染呈現(xiàn)為亮藍色(見箭頭所示)，且統(tǒng)計分析顯示，低氧促使細胞凋亡(P<0.05),見圖2B；同時，Annexin V-FITC/PI染色結果顯示,低氧組早期凋亡細胞數(shù)和晚期凋亡細胞數(shù)均顯著增加(P<0.05),見圖2C。

3 過表達CFTR或CFTR inh-172刺激對CFTR表達的影響

進一步對心肌 H9c2細胞轉染CFTR過表達質(zhì)?；蚪o予CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172刺激后構建低氧模型，觀察CFTR mRNA和蛋白水平,結果顯示，轉染CFTR過表達質(zhì)粒后，CFTR的mRNA和蛋白水平均顯著增加(P<0.05)；且過表達CFTR能逆轉低氧誘導的CFTR的mRNA和蛋白水平的降低(P<0.05)；在低氧環(huán)境下，CFTR-inh-172能降低過表達CFTR心肌H9c2細胞CFTR的mRNA和蛋白水平(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.Hypoxia treatment inhibited the viability and promoted apoptosis of H9c2 cardiomyocytes. A: cell viability was measured by MTT assay; B and C: the apoptosis was were determined by Hoechst 33342 and Annexin V-FITC/PI staining. The scale bars=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormoxia group.

圖2 低氧處理抑制心肌 H9c2細胞活力并促使其凋亡

Figure 3.Effect of CFTR overexpression or CFTRinh-172(CFTR specific inhibitor) on the mRNA and protein level of CFTR in H9c2 cardiomyocytes treated with hypoxia. A： the mRNA level of CFTR was examined by RT-qPCR; B: the protein level of CFTR was examined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormoxia group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia +CFTR-overexpression group.

圖3 過表達CFTR或CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對低氧處理的心肌H9c2細胞CFTR mRNA和蛋白水平的影響

4 CFTR拮抗低氧誘導的心肌 H9c2細胞損傷

在低氧環(huán)境下，進一步觀察過表達CFTR或CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對心肌 H9c2細胞活力和凋亡的改變。MTT結果顯示，CFTR過表達能升高低氧抑制的細胞活力(P<0.05)，CFTRinh-172抑制CFTR過表達誘導的細胞活力增加(P<0.05)，見圖4A。同時Hoechst 33342染色結果顯示，CFTR過表達能抑制低氧誘導的細胞凋亡(P<0.05)，CFTRinh-172則能逆轉CFTR過表達的作用(P<0.05),見圖4B。進一步采用Annexin V-FITC/PI 檢測細胞凋亡，結果顯示在常氧環(huán)境下，各組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在低氧環(huán)境下，CFTR過表達能抑制低氧誘導的細胞凋亡(P<0.05)，CFTRinh-172處理能進一步加劇低氧誘導的細胞凋亡(P<0.05)，CFTR過表達與CFTRinh-172聯(lián)合組細胞凋亡率較CFTR過表達組升高(P<0.05),見圖5。

Figure 4.CFTR over-expression antagonizes the injury of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia. A: cell viability was measured by MTT assay; B: the apoptotic rate was determined by Hoechst 33342 staining. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsnormoxia group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia+CFTR-overexpression group.

圖4 CFTR過表達拮抗低氧誘導的心肌H9c2細胞損傷

5 CFTR拮抗低氧誘導的心肌 H9c2細胞ROS的生成

DCF-DA探針檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的結果顯示，在常氧環(huán)境下，CFTR過表達或者CFTRinh-172并不影響ROS生成(P>0.05)；但低氧能促使心肌 H9c2細胞ROS的生成(P<0.05)；CFTR過表達可降低低氧誘導的心肌 H9c2細胞ROS的生成(P<0.05)；CFTRinh-172可進一步升高低氧環(huán)境下ROS的生成(P<0.05)，CFTR過表達與CFTRinh-172聯(lián)合組ROS生成量較CFTR過表達組升高(P<0.05),見圖6。以上結果提示CFTR拮抗低氧誘導的心肌 H9c2細胞損傷作用可能與抑制ROS生成相關。

討 論

低氧及其內(nèi)在調(diào)控機制在心血管疾病的生理過程中發(fā)揮著重要作用,比如：健康心臟以脂肪酸氧化為優(yōu)先供能模式，但是功能異常的心肌細胞主要以葡萄糖代謝為主，這其中低氧是主要誘發(fā)因素[10]，同時低氧也可以影響線粒體生成以及心肌細胞收縮性。因此，研究心肌細胞是如何應對低氧環(huán)境應激的對于解決心血管疾病具有重要意義。本研究使心肌 H9c2細胞直接暴露于1%氧氣含量的低氧環(huán)境，觀察CFTR對低氧損傷H9c2細胞的影響。本研究發(fā)現(xiàn)CFTR拮抗低氧誘導的心肌 H9c2細胞損傷，對細胞起保護作用。

接下來，我們對CFTR對心肌細胞的保護作用機制進行了探索。由于在腦血管平滑肌、腸道和肺部等細胞和神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)CFTR的蛋白功能失?？梢鹁€粒體氧化應激[11-14]。我們研究發(fā)現(xiàn)，CFTR過表達部分逆轉低氧誘導心肌 H9c2細胞ROS的生成，因此我們推測CFTR拮抗低氧對心肌 H9c2細胞的損傷作用可能與抑制ROS生成相關。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中即使恢復CFTR的表達也不能使細胞凋亡完全逆轉，這說明缺氧誘導的細胞凋亡還存在其它非CFTR依賴的機制。比如有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以抑制miR-532-5p，miR-499-5p等微小RNA的表達從而使其靶基因程序性細胞凋亡因子-4上調(diào)，促進心肌細胞凋亡[15-17]。

Figure 5.CFTR over-expression antagonizes the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormoxia group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia +CFTR-overexpression group;$P<0.05vshypoxia +CFTRinh-172 group.

圖5 CFTR過表達拮抗低氧誘導的心肌 H9c2細胞凋亡

Figure 6.CFTR antagonizes the production of ROS of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsnormoxia group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia+CFTR-overexpression group;$P<0.05vshypoxia +CFTRinh-172 group.

圖6 CFTR拮抗低氧誘導的心肌 H9c2細胞ROS的生成

低氧如何誘導CFTR表達下調(diào)的機制研究還需要進一步完善。雖然已有研究暗示一些啟動子和轉錄因子的結合在某些方面促進了CFTR的基因表達，但是這并不能充分解釋CFTR的組織特異性表達調(diào)控過程[15]。另外，心肌原代細胞在特定功能和表型上還與心肌 H9c2細胞具有一定的差異；還有CFTR在心肌原代細胞和整體動物上是否也能表現(xiàn)相似的生物學功能，都將是我們下步研究的重點。

綜上所述，目前我們的研究結果提示CFTR可作為心肌缺血等低氧相關性心血管疾病的潛在治療靶標，但具體作用機制仍有待進一步闡明。