宋仕聰， 阮云軍， 吳賽珠， 王玉筵

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院老年病科， 廣州 廣東 510080)

根據(jù)2017年4月23日發(fā)布的《2016年度中國大陸冠心病介入治療數(shù)據(jù)》[1]，2016年我國接受冠心病介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)例數(shù)超過66萬，其中置入藥物支架(drug eluting stents，DES)占99.6%，接受PCI患者平均年齡62歲。越來越多的老年人接受支架植入手術(shù)，在數(shù)量龐雜的DES中，雷帕霉素(rapamycin，Rapa)及其衍生物載藥支架因出色的抗炎和抗增殖作用而廣泛地應(yīng)用于臨床預(yù)防支架內(nèi)再狹窄，是目前臨床上最常應(yīng)用的DES。

Rapa是一種具有三烯大環(huán)內(nèi)脂結(jié)構(gòu)的化合物，也是第1個(gè)已知的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)特異性抑制劑，而mTOR是參與細(xì)胞衰老、增殖和凋亡等生理活動(dòng)的重要信號(hào)通路，因此Rapa可通過調(diào)控mTOR通路參與多種生理活動(dòng)。研究證實(shí)，Rapa可延緩神經(jīng)系統(tǒng)衰老相關(guān)疾病，如阿爾茲海默和帕金森等疾病的發(fā)生發(fā)展[2-3]，從而起到一定的抗衰老作用，但Rapa對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells, VECs)的影響尚未見報(bào)道，特別是面對(duì)我國數(shù)量龐大的老年冠心病PCI術(shù)后患者，這些老年患者的VECs往往伴有不同程度的衰老，明確Rapa對(duì)這些老年患者VECs衰老的影響有利于為PCI術(shù)后患者的二級(jí)預(yù)防提供參考。為此我們開展了本研究，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道如下。

材 料 和 方 法

1 主要材料及儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)由南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。Rapa和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)均購自Selleck；細(xì)胞用H2O2購自上海麥克林公司；澳洲胎牛血清和無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基均購自Gibco；MTT購自Sigma-Aldrich；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal)染色試劑盒購于上海碧云天公司；兔抗人β-actin、Rb、磷酸化Rb、LC3B、beclin-1和p21Ⅰ抗均購自CST。半干轉(zhuǎn)印儀購自Bio-Rad；日立H-7650透射電子顯微鏡購自日立公司；酶標(biāo)儀購自Thermo。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs復(fù)蘇后予含10%FBS的無酚紅DMEM培養(yǎng)液置于37.0 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)；隔日換液；待細(xì)胞融合率達(dá)80%進(jìn)行傳代；取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞分組和處理 將細(xì)胞隨機(jī)分為：(1)空白(blank)組：予以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；(2)衰老(H2O2)組：予以正常培養(yǎng)液加終濃度200 nmol/L H2O2孵育24 h；(3)Rapa+H2O2組：在衰老組處理的基礎(chǔ)上，根據(jù)Rapa說明書先予以10 μmol/L 的Rapa預(yù)處理0.5 h；(4)3-MA+H2O2組：在衰老組處理的基礎(chǔ)上，根據(jù)3-MA說明書先予以50 μmol/L的3-MA預(yù)處理0.5 h。

2.3MTT比色法檢測細(xì)胞活力 將細(xì)胞以1.0×108/L的密度接種于96孔板，每孔100 μL，各組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，各組處理如上述；然后棄去舊培養(yǎng)液，加入DMEM與MTT比例為10∶1的不含血清混合培養(yǎng)基，避光孵育2 h；最后棄去含MTT培養(yǎng)基，每個(gè)孔中依次加入150 μL DMSO，震蕩5 min后酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞SA-β-Gal染色 HUVECs消化離心后以適當(dāng)密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)50%～60%后進(jìn)行細(xì)胞分組處理；清洗細(xì)胞，每個(gè)孔各加入4%多聚甲醛1 mL，室溫固定15 min；按照1∶1∶93比例加入染色液A、B和C，最后按每1 mL加入50 μL的比例加入X-Gal溶液配置成染色工作液；清洗細(xì)胞后每孔中加入1 mL染色工作液，保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)，37 ℃不含CO2孵育箱過夜；最后普通光學(xué)顯微鏡拍照，100×視野下每組隨機(jī)觀察5個(gè)視野，記錄各組5個(gè)視野總共藍(lán)染細(xì)胞的個(gè)數(shù)及觀察總數(shù)，以陽性個(gè)數(shù)/總細(xì)胞數(shù)代表衰老水平。

2.5透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，然后根據(jù)不同分組予相應(yīng)處理；消化細(xì)胞，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，離心；沿著各個(gè)EP管壁緩慢加入1 mL預(yù)冷的5%戊二醛固定液，4 ℃固定24～48 h；環(huán)氧樹脂Epon812包埋劑37 ℃浸透過夜；再將細(xì)胞包埋，60 ℃聚合48 h；在AO超薄切片機(jī)下切1 μm的半薄切片，用銅網(wǎng)撈片；醋酸鈾染色3 min，雙蒸水漂洗，鉛染色3 min，雙蒸水漂洗，自然風(fēng)干；觀察，拍照。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) HUVECs分組處理如上述，加入RIPA冰上裂解30 min提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。在組裝好的電泳玻璃板中加入10%過硫酸銨、四甲基二乙胺、30%丙烯酰胺(30%Acr-Bis)、蒸餾水等配制成適當(dāng)濃度的堆積膠與分離膠，插入梳子，每孔加入20 μL總蛋白，完成后續(xù)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別以抗Rb、p-Rb、LC3B、beclin-1、p21和β-actinⅠ抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，37 ℃孵育Ⅱ抗1 h，TBST洗膜3次，ECL顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組之間的比較分析采用單因素方差分析法，組間多重比較采用最小顯著差異(LSD)法；兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；率之間的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 衰老組細(xì)胞活力降低，而Rapa可增強(qiáng)細(xì)胞活力

200 nmol/L的H2O2可使細(xì)胞活力降低，與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)，后續(xù)的衰老染色及Western blot證實(shí)細(xì)胞衰老模型構(gòu)建成功，這與我們前期研究結(jié)果一致[4]。與衰老組相比，Rapa組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，但予以自噬抑制劑3-MA后細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，見圖1。

2 Rapa可延緩細(xì)胞衰老，3-MA加速細(xì)胞衰老

與空白組相比，經(jīng)H2O2作用的衰老組細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)藍(lán)染增多，SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.05)，p-Rb表達(dá)增多(P<0.05)，p-Rb/Rb比值增大，p21表達(dá)增多(P<0.05)。與衰老組相比，加入Rapa預(yù)處理的HUVECs衰老染色陽性細(xì)胞減少(P<0.05)，細(xì)胞體積相對(duì)正常，p-Rb表達(dá)減少(P<0.01)，p21表達(dá)減少(P<0.05)；相反地，加入自噬抑制劑3-MA組細(xì)胞衰老染色陽性細(xì)胞增多(P<0.05)，胞體皺縮、變形，胞核藍(lán)染，同時(shí)伴有p-Rb和p21表達(dá)增多(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.MTT assays were performed to assess cell viability in each group. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsblank group；*P<0.05vsH2O2group.

圖1 MTT檢測各組細(xì)胞活力

Figure 2.The senescence indicators of each group. A: the results of SA-β-Gal staining, the senescent cells were stained in deep blue, while pretreatment with Rapa reduced the blue staining cells; B: the protein expression levels of p-Rb, Rb, p21 and β-actin in different groups were detected by Western blot. Mean±SD.n=5.##P<0.01vsblank group；*P<0.05vsH2O2group.

圖2 各組細(xì)胞衰老指標(biāo)檢測

3 Rapa組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，并伴有自噬小體形成

空白組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，線粒體豐富；衰老組細(xì)胞腫脹，線粒體數(shù)量減少，線粒體嵴消失，空泡化明顯，可見線粒體腫脹；Rapa組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，與空白組相比線粒體數(shù)量減少，但可見雙層膜包繞著待降解物的結(jié)構(gòu)，即自噬小體；3-MA組細(xì)胞腫脹，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體進(jìn)一步減少且腫脹明顯，可見胞質(zhì)空泡化，未見自噬小體，見圖3。

Figure 3.The subcellular structure of cells in different groups observed by TEM. Red cycles show the mitochondria; red arrows indicate the formation of autophagosomes; yellow arrows show the vacuolation of mitochondria; blue arrows show the vacuolation of cytoplasm.

圖3 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

4 Rapa組自噬活性升高，3-MA抑制細(xì)胞自噬

與空白組相比，衰老組beclin-1和LC3-II表達(dá)增多(P<0.05)；與衰老組相比，Rapa組beclin-1和LC3-II表達(dá)增多更為顯著(P<0.01)；與衰老組比較，3-MA組自噬活性顯著降低(P<0.05)，見圖4。

討 論

Rapa分子式為C51H79NO13，是第1代DES常用的涂層藥物，可通過阻斷細(xì)胞周期中G1期向S期轉(zhuǎn)換從而抑制血管平滑肌細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致的支架內(nèi)狹窄[5]。同時(shí)由于Rapa具有獨(dú)特的對(duì)mTOR抑制作用，可通過抑制mTOR促進(jìn)自噬泡的形成，因而Rapa是研究自噬最常用的工具藥物。由于VECs與血液循環(huán)中的促動(dòng)脈粥樣硬化因子，如ox-LDL、高糖、活性氧和炎癥因子等直接接觸，因此VECs又稱為抗動(dòng)脈粥樣硬化“第一道防線”。VECs衰老往往伴有屏障功能和內(nèi)分泌功能下降，是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[6]，心腦血管疾病發(fā)病率隨著年齡逐漸增加的一個(gè)重要原因就是由于VECs衰老降低了這些疾病的發(fā)病閾值[7]。因此，探索VECs衰老的機(jī)制，研發(fā)抗衰老藥物是防治心腦血管疾病行之有效的途徑。

Figure 4.The protein expression of autophagy proteins of each group. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsblank group；*P<0.05vsH2O2group.

圖4 各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)分析

本研究揭示，Rapa可促進(jìn)VECs自噬，表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增多及透射電鏡捕捉到的自噬小體；而Rapa在激活VECs自噬的同時(shí)可延緩衰老，表現(xiàn)在細(xì)胞活力的增強(qiáng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改善及衰老相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的減少；相反地，給予自噬抑制劑3-MA則使細(xì)胞衰老加速；因此，我們推測激活自噬是Rapa延緩VECs衰老的重要機(jī)制。

Rapa藥物涂層支架置入冠脈后，以“先快后慢”的形式釋放，一般在30 d左右藥物釋放率達(dá)80%以上，殘余的Rapa以極低濃度繼續(xù)作用于血管，起到抑制內(nèi)皮化的作用[8]。研究證實(shí)，低濃度的Rapa可通過促進(jìn)血管平滑細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞過度增殖[9-10]，但對(duì)VECs功能和結(jié)構(gòu)影響如何還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度Rapa可改善活性氧誘導(dǎo)的VECs衰老，改善細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這與國內(nèi)外其它研究相符，如李錦等[11]證實(shí)Rapa通過激活自噬延緩高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞衰老，減少腎系膜細(xì)胞SA-β-Gal染色陽性率；秦登科等[12]使用Rapa減輕成纖維細(xì)胞衰老的研究等。我們認(rèn)為，Rapa除了通過抑制血管平滑肌增生起到抗增殖作用之外，還可通過延緩VECs衰老，減少VECs遷移和增殖刺激，從而避免了VECs過度增生，抑制血管內(nèi)皮化，發(fā)揮抑制支架內(nèi)再狹窄的作用。事實(shí)上國外學(xué)者早已通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老與PCI術(shù)后再狹窄發(fā)生息息相關(guān)，是再狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]，其具體機(jī)制可能與衰老的內(nèi)皮祖細(xì)胞一方面轉(zhuǎn)化成衰老的VECs，另一方面衰老的內(nèi)皮祖細(xì)胞和衰老的VECs共同分泌血管緊張素、內(nèi)皮素1和生長因子等，促進(jìn)血管平滑肌遷移、增殖，加速內(nèi)膜增生，導(dǎo)致再狹窄發(fā)生[14]。

同時(shí)，我們的研究提示自噬與衰老存在聯(lián)系，適當(dāng)?shù)厣险{(diào)自噬可延緩衰老。研究表明，在小鼠中過表達(dá)自噬相關(guān)基因ATG5可使這些小鼠壽命延長17.2%[15]；使用Rapa可明顯減輕氧剝奪導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[16]，這些結(jié)果都與本研究相互印證。適當(dāng)?shù)厣险{(diào)自噬可延緩衰老，特別是在本研究中所使用的H2O2誘導(dǎo)VEC衰老，活性氧可通過直接作用激活蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)，AKT通過磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(TSC2)，導(dǎo)致TSC1-TSC2復(fù)合物形成障礙，激活小G蛋白R(shí)HEB，從而激活mTOR[17]，抑制自噬；各種致衰老因子如活性氧、缺氧、營養(yǎng)缺乏均將直接導(dǎo)致TSC2磷酸化增加，TSC1-TSC2復(fù)合物形成障礙，RHEB被激活，從而激活mTOR，抑制自噬，加速細(xì)胞衰老[18]。另外，細(xì)胞衰老的重要驅(qū)動(dòng)因素就是胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白、受損DNA和受損細(xì)胞器增多，細(xì)胞新陳代謝減緩，而自噬恰好可以把這些大分子物質(zhì)和受損的細(xì)胞器降解成葡萄糖、氨基酸等供機(jī)體循環(huán)利用，從而起到一定延緩衰老作用[19]。值得注意的是，自噬的抗衰老作用只在細(xì)胞衰老的初期起作用，在衰老的終末階段，過度的自噬反而會(huì)加劇自身消耗，加速細(xì)胞衰老。

另外，我們注意到與空白組相比，衰老組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增多，這是因?yàn)檎T導(dǎo)衰老所使用的H2O2作為一種外源性活性氧，可導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，而自噬作為細(xì)胞在特定環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)整活動(dòng)，會(huì)在應(yīng)激時(shí)顯著增強(qiáng)[20]。相反地，予以自噬抑制劑3-MA后，這種適應(yīng)性調(diào)整被完全阻斷，衰老加劇，細(xì)胞功能更差，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯。

綜上所述，本研究觀察到Rapa可延緩H2O2誘導(dǎo)的VECs衰老，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)自噬相關(guān)。但是，由于本研究是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，仍缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。而且，Rapa作為一種抗生素同時(shí)具有抗炎作用，Rapa的抗衰老作用不能簡單推斷由激活自噬導(dǎo)致的，還可能與抗炎作用相關(guān)。因此，還需要更多的研究明確Rapa延緩VECs衰老的機(jī)制，為心腦血管疾病的防治提供參考。