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        和厚樸酚通過mTOR信號通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞自噬*

        2019-07-30 08:32:26吳愛祥邵中一蘇賽賽
        中國病理生理雜志 2019年7期
        關(guān)鍵詞:孔板培養(yǎng)箱肺癌

        羅 敏, 繆 萍, 吳愛祥, 邵中一, 楊 華, 蘇賽賽

        (鄞州人民醫(yī)院, 浙江 寧波 315040)

        肺癌是我國發(fā)病率最高的腫瘤之一,同時具有低齡化發(fā)展的趨勢,因此,針對肺癌的研究一直是抗腫瘤研究的重點[1]。和厚樸酚(honokiol)為一種帶有烯丙基的聯(lián)苯二酚類化合物,是從中藥厚樸中提取到的主要活性物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)活性,包括抗菌、抗炎、中樞性肌肉松弛和神經(jīng)抑制作用、抗血小板、降低膽固醇及抗腫瘤等藥理作用[2-3]。近年研究表明,honokiol對乳腺癌[4]、結(jié)腸癌[5]和前列腺癌[6]等腫瘤都有抑制作用,其作用機制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管形成、抑制酶的活性以及蛋白質(zhì)的合成等有關(guān)。然而,honokiol是否誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬,目前未見報道。因此,本實驗通過體外研究觀察honokiol對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞自噬的作用及可能的作用機制,旨在為honokiol用于肺癌的臨床治療提供參考資料。

        材 料 和 方 法

        1 材料

        1.1細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

        1.2主要試劑 Honokiol購自西安天一生物技術(shù)有限公司,純度>99%;吖啶橙(acridine orange)、二甲基亞砜(DMSO)和雷帕霉素(rapamycin)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)購自Sigma;胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;胎牛血清購自Gibco;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于碧云天生物公司;抗LC3、p-mTOR、mTOR和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology。

        2 方法

        2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌A549細(xì)胞于含10%小牛血清,1.0×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次。

        2.2MTT實驗檢測細(xì)胞活力 消化A549細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,以每孔5.0×103個細(xì)胞接種于96孔板中,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天實驗組中加入不同濃度的honokiol,其濃度分別為10、20、40、60和80 μmol/L,對照組中加入等體積的PBS,每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入濃度為2 g/L的MTT 20 μL,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去96孔板中的液體,每孔加入DMSO 150 μL,將96孔板低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。

        2.3吖啶橙染色 收集A549細(xì)胞,將細(xì)胞以5×107/L的細(xì)胞懸液接種于24孔板,每孔1 mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)過夜,第2天加入不同濃度的honokiol和rapamycin作用于肺癌A549細(xì)胞48 h, 棄去24孔板中的舊培養(yǎng)液,用PBS清洗3遍,用含終濃度為1 mg/L的吖啶橙溶液避光染色15 min,用PBS清洗染色后的細(xì)胞,清洗3遍,置倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,拍照。實驗重復(fù)3次。

        2.4Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平 收集肺癌A549細(xì)胞,將細(xì)胞以1×108/L接種于6孔板中,每孔2 mL,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。對照組給予正常培養(yǎng)液,給藥組分別給予honokiol (40 μmol/L)和honokiol (40 μmol/L)+3-MA (10 mmol/L) 48 h,其中3-MA在收細(xì)胞前2 h加入。收集各組藥物處理后的細(xì)胞,提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度進(jìn)行定量。將定量后的蛋白樣品加入到配制好的丙烯酰胺凝膠泳道中電泳分離, 然后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含5% BSA將膜封閉1 h,TBST清洗3次,分別加入對應(yīng)I抗LC3(1∶1 000)、p-mTOR (1∶1 000)、mTOR (1∶1 000)和GAPDH (1∶2 000),4 ℃孵育過夜,次日用TBST洗膜后,加入對應(yīng)羊抗兔II抗 (1∶3 000),室溫?fù)u床孵育2 h后,TBST洗膜3次,ECL發(fā)光試劑盒顯色,采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光采圖,從而進(jìn)行半定量分析。

        3 統(tǒng)計學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 和厚樸酚抑制肺癌A549細(xì)胞活力

        采用MTT法檢測honokiol對肺癌A549細(xì)胞活力的影響,實驗結(jié)果顯示,與對照(0 μmol/L)組相比,不同濃度的honokiol對肺癌A549細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響,honokiol能顯著抑制肺癌A549細(xì)胞活力(P<0.01),并呈一定的劑量依賴關(guān)系,見圖1。在給藥48 h后,honokiol的IC50為60.05 μmol/L。

        Figure 1.The effect of different concentrations of honokiol on the viability of A549 cells after 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

        圖1 不同濃度的和厚樸酚對肺癌 A549 細(xì)胞活力的影響

        2 和厚樸酚促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞自噬溶酶體的生成

        吖啶橙染色可使細(xì)胞中酸性自噬泡發(fā)出紅色熒光。結(jié)果顯示,雷帕霉素(100 nmol/L)作為陽性對照處理細(xì)胞后細(xì)胞中發(fā)出紅色熒光的酸性自噬泡的比例明顯增多;honokiol(20和40 μmol/L)作用于肺癌A549細(xì)胞48 h后,細(xì)胞中發(fā)出亮紅色熒光的酸性自噬泡的比例增多,其中以40 μmol/Lhonokiol效果最為明顯,見圖2。因此,后續(xù)實驗選擇40 μmol/L作為實驗濃度。

        Figure 2.The changes of autophagy levels in A549 cells after treated with honokiol (acridine orange staining, ×400).

        圖2 不同濃度的和厚樸酚對肺癌A549細(xì)胞自噬的影響

        3 和厚樸酚增加肺癌A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)

        在40 μmol/L的honokiol作用下,自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);然而,聯(lián)合自噬抑制劑3-MA作用則能明顯下調(diào)由honokiol誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平(P<0.01),見圖3。

        Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅱ in the lung cancer A549 cells treated with honokiol. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshonokiol group.

        圖3 和厚樸酚對肺癌A549細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

        4 和厚樸酚抑制肺癌A549細(xì)胞mTOR信號通路

        Western blot檢測結(jié)果顯示,肺癌A549細(xì)胞在40 μmol/L的honokiol作用48 h后,與空白對照組相比,honokiol可顯著降低p-mTOR的蛋白表達(dá)水平(P<0.01);聯(lián)合自噬抑制劑3-MA作用后,p-mTOR蛋白表達(dá)水平呈顯著升高(P<0.01),而mTOR的總蛋白水平無明顯變化,見圖4。

        Figure 4.The protein levels of p-mTOR in the lung cancer A549 cells treated with honokiol. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshonokiol group.

        圖4 和厚樸酚對肺癌A549細(xì)胞p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

        討 論

        肺癌是全球危害性最大的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率在全球持續(xù)上升,且低齡化趨勢越來越明顯?;熓悄壳胺伟┯行У闹委煼椒ㄖ?,但化療的毒副作用較大,在臨床應(yīng)用方面受到了很大的限制,故尋找治療肺癌的新方法及新策略是研究的熱點[7]。和厚樸酚為聯(lián)苯二酚類化合物,是從中藥厚樸中提取到的主要活性物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)活性。Honokiol通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤組織血管生成等來發(fā)揮其抗腫瘤的作用[8-9]。研究表明,honokiol可抑制人肺小細(xì)胞癌N446細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo) N446 細(xì)胞凋亡[10]。Wang等[11]報道honokiol能增強紫杉醇藥物的敏感性。自噬又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,廣泛存在于真核細(xì)胞,對細(xì)胞的生長發(fā)育和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用。目前普遍認(rèn)為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機制,當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到各種損傷因素作用時,自噬可以成為細(xì)胞應(yīng)激條件下的一種保護(hù)反應(yīng)[12]。大量研究表明,大多數(shù)抗腫瘤藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時也誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,該自噬可以成為細(xì)胞應(yīng)激條件下的一種保護(hù)性反應(yīng),使細(xì)胞維持自身微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),從而耐受化療藥物的細(xì)胞毒性[13]。本研究通過檢測吖啶橙染色及自噬相關(guān)蛋白分子LC3-II表達(dá)的變化,表明了honokiol誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬。由于自噬的特點,藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬有2種不同的結(jié)果,一種是細(xì)胞在應(yīng)激條件下的一種保護(hù)反應(yīng),而另一種則是啟動細(xì)胞Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。應(yīng)用自噬抑制劑3-MA抑制自噬后,觀察到3-MA 減弱了honokiol對A549 細(xì)胞自噬水平的抑制作用,結(jié)合Luo等[14]報道honokiol聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖,提示自噬是honokiol的抗腫瘤作用機制而不是細(xì)胞自身的一種保護(hù)性機制。

        目前已發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬的上游相關(guān)信號通路有很多條,包括mTOR、PI3K/AKT、ROS和NF-κB信號通路等,其中mTOR信號通路是研究廣泛的信號通路之一,而其核心蛋白 mTOR的活化是決定自噬體形成和成熟的關(guān)鍵蛋白[15-16]。在生長因子和應(yīng)激等情況下,mTOR被激活,呈磷酸化狀態(tài),它可以磷酸化其下游靶點,抑制細(xì)胞自噬,促進(jìn)細(xì)胞增殖,因此,mTOR 對細(xì)胞自噬起負(fù)向調(diào)控作用。應(yīng)用Western blot 方法檢測honokiol對肺癌A549細(xì)胞mTOR的影響,實驗結(jié)果顯示honokiol可顯著抑制肺癌A549細(xì)胞中p-mTOR的表達(dá),表明honokiol可顯著抑制肺癌A549細(xì)胞內(nèi)mTOR的活化。同時加入自噬抑制劑3-MA 和honokiol時,與單獨加入honokiol相比,p-mTOR表達(dá)有所恢復(fù),說明抑制細(xì)胞自噬,可削弱honokiol對肺癌細(xì)胞內(nèi)p-mTOR的抑制作用,提示honokiol可能通過抑制mTOR信號通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬。

        綜上所述, 本實驗通過檢測自噬溶酶體、自噬標(biāo)志物以及相關(guān)的信號通路,研究honokiol對肺癌 A549細(xì)胞自噬的影響,表明一定劑量的honokiol可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬,并且該作用可能通過抑制mTOR信號通路有關(guān),為honokiol在肺癌的臨床應(yīng)用提供參考資料。

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