粟連秀， 陳靜平， 楊達(dá)平， 鐘再嬋， 黃麗芳， 宋建華， 韋翠容

(廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院 1病理科， 2婦科， 廣西 貴港 537100)

卵巢癌是繼子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌發(fā)生率居第3的婦科惡性腫瘤，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首[1]。治療過程中腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是卵巢癌相關(guān)性死亡的最主要原因[2]。因此，探尋卵巢癌的特異性治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。生物鐘基因Timeless(以下簡稱TIM)位于人類第12號染色體上，長約43 kb，編碼產(chǎn)物為TIM蛋白，它可以與另一生物鐘基因Per形成異二聚體，行使其調(diào)節(jié)生物節(jié)律的功能，是維持內(nèi)源性生物鐘運(yùn)作的核心元件[3-4]。近年來研究表明，包括TIM在內(nèi)的多種生物鐘基因廣泛參與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，如乳腺癌[5]、肺癌[6]和肝癌[7]等。但TIM與卵巢癌的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)沉默人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中TIM表達(dá)，并分析TIM表達(dá)下調(diào)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響，初步探討TIM在卵巢癌治療中的靶點(diǎn)作用，以期為卵巢癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

卵巢癌SKOV3細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。LipofectamineTM2000購自Invitrogen；TIMsiRNA、siRNA對照、鼠抗人TIM單克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)多克隆抗體和兔抗人MMP-9多克隆抗體均購自Santa Cruz；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；凋亡檢測試劑盒購自BD。

2 方法

2.1免疫組化染色 選取50例卵巢癌組織樣本及50例正常卵巢組織樣本。采用免疫組化染色檢測卵巢癌組織及正常卵巢組織中TIM蛋白的表達(dá)?？乖迯?fù)采用煮沸修復(fù)法，免疫組化染色采用EnVision二步法。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青霉素和鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。收集對數(shù)生長期細(xì)胞。

2.3轉(zhuǎn)染及分組 待細(xì)胞生長至85%～90%匯合時(shí)，收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×109/L，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。細(xì)胞接種后24 h，將細(xì)胞分為3組，即空白對照(blank control)組、siRNA對照(siRNA control)組和TIMsiRNA組，siRNA對照組和TIMsiRNA組分別轉(zhuǎn)染siRNA對照和TIMsiRNA，空白對照組未轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作參照LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染之后，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，6 h后取出換液，之后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞蛋白裂解液提取總蛋白，定量蛋白濃度，行10% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%封閉液4 ℃封閉2 h，加入 I 抗(TIM、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、MMP-2、MMP-9和β-actin，均1∶100)，4 ℃搖床孵育過夜，加入 II 抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，ECL反應(yīng)1～3 min，暗室曝光，顯影、定影處理，Image-Pro Plus軟件分析數(shù)據(jù)。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS緩沖液漂洗，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)，離心、棄上清，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入Annexin V-FITC和propidium iodide各5 μL，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2.6Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 于小室上室鋪上50 μL Matrigel(F12K培養(yǎng)基1∶3稀釋)，收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，并將100 μL單細(xì)胞懸液加入上室，下室加入500 μL含20%FBS的F12K完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。棄上室液體，用棉簽擦拭聚碳酸酯膜上層的細(xì)胞及Matrigel，用4%多聚甲醛固定濾膜下層，HE染色，倒置顯微鏡下觀察，取5個(gè)視野，200倍鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分比)[n(%)]表示，組間比較采用2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組織化學(xué)染色觀察

TIM在正常卵巢組織中呈陰性表達(dá)，而在卵巢癌組織中呈陽性表達(dá)，表現(xiàn)為棕黃色著色，主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞周圍,見圖1。50例卵巢癌組織中TIM陽性表達(dá)率為84.0%(42/50)，50例正常卵巢組織中TIM陽性表達(dá)率為10.0%(5/50)，卵巢癌組織中TIM陽性表達(dá)率顯著高于正常卵巢組織(P<0.01)。

Figure 1.Immunohistochemical detection of TIM expression in normal ovarian and ovarian cancer tissues (×100).

圖1 正常卵巢和卵巢癌組織中TIM表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果

2 TIM表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

TIM蛋白表達(dá)與卵巢癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡和病理類型無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 TIM表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

Table 1.The relationship between TIM expression and clinicopathologic features of ovarian cancer [n(%)]

Pathological factors nTIM positiveAge >50 years2925(86.2) ≤50 years2117(80.9)Pathological pattern Serous type2722(81.5) Mucinous type2320(86.9)Differentiation degree Poorly-differentiated2626(100.0)?? High-differentiated/middle-differentiated2416(66.7)Infiltration depth T1+T2125(41.7)?? T3+T43837(97.4)Lymphnode metastasis Negative149(64.3)? Positive3633(91.7)TNM Ⅰ+Ⅱ1812(66.7)? Ⅲ+Ⅳ3230(93.8)

*P<0.05,**P<0.01vsother groups.

3 各組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中TIM蛋白的表達(dá)

TIMsiRNA組中TIM的蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)；空白對照組和siRNA對照組之間TIM蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖2。

4 沉默TIM基因的表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

TIMsiRNA組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)；空白對照組和siRNA對照組之間細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖3。

5 沉默TIM基因的表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

TIMsiRNA組中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)，而Bax蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)；空白對照組和siRNA對照組之間Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖4。

6 沉默TIM基因的表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響

TIMsiRNA組的細(xì)胞穿膜數(shù)顯著低于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)；空白對照組和siRNA對照組之間細(xì)胞穿膜數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖5。

Figure 2.Western blot was used to detected the TIM protein expression in blank control group, siRNA control group and TIM siRNA group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group and siRNA control group.

圖2 空白對照組、siRNA對照組和TIM siRNA組中TIM蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

Figure 3.The apoptotic rate in blank control group, siRNA control group and TIM siRNA group was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group and siRNA control group.

圖3 空白對照組、siRNA對照組和TIM siRNA組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

7 沉默TIM基因的表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

TIM siRNA組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)；空白對照組和siRNA對照組之間MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 4.The protein expression of Bcl-2 and Bax in blank control group, siRNA control group andTIMsiRNA group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group and siRNA control group.

圖4 空白對照組、siRNA對照組和TIMsiRNA組中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

Figure 5.The invasion ability in blank control group, siRNA control group andTIMsiRNA group was detected by Transwell chamber test. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group and siRNA control group.

圖5 空白對照組、siRNA對照組和TIMsiRNA組細(xì)胞侵襲能力的Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

8 沉默TIM對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的影響

TIMsiRNA組中caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組和siRNA對照組(P<0.01)，見圖7。

Figure 6.The protein expression of MMP-2 and MMP-9 in blank control group, siRNA control group andTIMsiRNA group was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group and siRNA control group.

圖6 空白對照組、siRNA對照組和TIMsiRNA組中MMP-2和MMP9蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

Figure 7.The protein expression of caspase-3 and caspase-9 in blank control group, siRNA control group andTIMsiRNA group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group and siRNA control group.

圖7 空白對照組、siRNA對照組和TIMsiRNA組中caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

討 論

卵巢癌發(fā)病隱匿，缺乏早期的典型癥狀，故早期診斷困難，大多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，并出現(xiàn)廣泛的腹腔轉(zhuǎn)移，根治手術(shù)難以實(shí)施。同時(shí)，由于化療耐藥等原因，卵巢癌5年生存率較低。當(dāng)前，卵巢癌的臨床診療存在“2個(gè)70%”：超過70%的卵巢癌患者確診時(shí)已為晚期，約70%的卵巢癌患者在治療后2年內(nèi)復(fù)發(fā)[8]。因此，迫切需要明確卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，提高其臨床診療水平。

生物鐘節(jié)律是指生物體對其所生存的周期性環(huán)境作出的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。生物鐘作為一種內(nèi)源性定時(shí)體系，它可使機(jī)體行為和生理呈現(xiàn)近似24 h的節(jié)律，并以此調(diào)節(jié)血壓、睡眠、激素分泌和免疫活動等生理過程。當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境影響時(shí)，如應(yīng)激、輻射和藥物等，可引起DNA損傷而使生物鐘節(jié)律重新設(shè)置[9]。生物鐘紊亂會增加包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[10]。生物鐘基因是產(chǎn)生和維持生物晝夜節(jié)律的分子基礎(chǔ)，而TIM則是生物鐘基因家族的重要成員之一[11]。Chi等[12]研究表明，過表達(dá)TIM有助于提高惡性腫瘤的存活及增殖，提示TIM表達(dá)上調(diào)對于促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。為了初步闡明Timeless在卵巢癌中的作用及機(jī)制，我們將TIM的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIMsiRNA能顯著下調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中TIM蛋白表達(dá)，該結(jié)果為進(jìn)一步研究TIM在卵巢癌中的功能奠定了基礎(chǔ)。

凋亡抵抗是多種惡性腫瘤共有的特性，也是導(dǎo)致放化療效果不佳的主要因素。Elgohary等[13]研究顯示，TIM表達(dá)下調(diào)可顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，提示TIM對肝癌細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用。本研究中，為探討TIM對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，我們分析了沉默TIM后卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TIMsiRNA可顯著誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TIMsiRNA能顯著降低Bcl-2的蛋白表達(dá)，并提高Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)。上述結(jié)果提示，沉默TIM可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能與caspase-3/caspase-9介導(dǎo)的凋亡信號通路啟動有關(guān)。遠(yuǎn)處侵襲是腫瘤細(xì)胞最典型的生物學(xué)特征之一，在該過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)參與其中，并發(fā)揮侵襲誘導(dǎo)作用。Reszka等[14]研究表明，在乳腺癌組織中，Per、Cry及Clock等大多數(shù)生物鐘基因均呈現(xiàn)低表達(dá)，但TIM在其中卻呈高表達(dá)，且在侵襲性乳腺癌中其表達(dá)上調(diào)更為顯著，提示TIM可能具有介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲的作用。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TIMsiRNA可顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲水平，同時(shí)可顯著降低MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平。上述結(jié)果提示，沉默TIM可降低卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力，且機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，利用siRNA 沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞中TIM表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲。