繆存靜， 陳俊杰， 歷 星， 林鵬程， 胡 全

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)藥學(xué)部， 浙江 杭州 310018； 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 浙江 溫州 325000； 3杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系， 浙江 杭州 310036)

肺癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年升高，其中非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%[1]。侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的重要原因，也是肺癌治療中最為棘手的問題。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition, EMT)被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移或擴散早期的重要環(huán)節(jié)，一直為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究的熱點[2]。木犀草素(luteolin)是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用[3]。研究報道luteolin對肝癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種腫瘤細胞的增殖具有抑制作用[4-5]，同時也發(fā)現(xiàn)EMT在乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[6-7]。但luteolin對由轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)的肺癌細胞EMT是否有影響，尚無相關(guān)報道。由于轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因，因此，研究肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制對治療肺癌和提升患者的生存率有重要意義。本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細胞建立EMT模型，探討luteolin對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用，以期為新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料及儀器

肺癌A549細胞購自中國科學(xué)院上海細胞所。TGF-β1購自PeproTech；胎牛血清購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)液購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；木犀草素購自Sigma；四甲基偶氮唑鹽(MTT)和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物公司；ECL超敏發(fā)光液購自Millipore；抗波形蛋白(vimentin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞以5.0×107/L的濃度調(diào)整細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入體積100 μL，然后置37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜待細胞貼壁后，加入不同濃度(5、10、20、40、80和160 μmol/L)的lu-teolin處理，以二甲基亞砜(DMSO)溶劑組為對照組，每個濃度設(shè)平行重復(fù)6孔。將細胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL和80 μL無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。最后，吸棄培養(yǎng)板中的上清，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩5 min使結(jié)晶充分溶解，酶標儀490 nm波長處測定吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。

2.2肺癌A549細胞EMT模型的建立 取對數(shù)生長期肺癌A549細胞，消化離心，調(diào)整細胞懸液約1×108/L，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入含5 μg/L的無血清TGF-β1培養(yǎng)液，同時，以無血清不含TGF-β1培養(yǎng)液作為對照，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

2.3細胞侵襲實驗 用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液按1 ∶3稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取50μL稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室的上室中，置于37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)1 h， 使基質(zhì)膠凝固。用無血清培養(yǎng)液配制各組終濃度的藥物，同時將TGF-β1誘導(dǎo)24 h的細胞用無血清的對應(yīng)組藥物制成8×107/L細胞懸液；取200 μL的含藥細胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h。取出小室，將上室液體棄去，用棉簽頭輕輕擦去上室未穿膜的細胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗后，甲醇固定30 min后，將Transwell 小室倒置自然風干。然后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS清洗，在倒置顯微鏡下觀察拍照，隨機選取5個視野計數(shù)每孔穿膜細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.4Western blot法檢測相關(guān)蛋白水平變化 采用5 μg/L的TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細胞24 h，顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變，然后加入不同濃度的luteolin處理細胞24 h。用RIPA裂解液裂解提取誘導(dǎo)前后及干預(yù)前后各組細胞的總蛋白，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。取蛋白樣品15 μg等量上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白，利用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，然后現(xiàn)配脫脂牛奶溫室封閉1 h，將膜用TBST清洗后，分別加入鼠抗人E-cadherin、vimentin和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG抗體室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進行曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，并分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 木犀草素抑制肺癌A549細胞活力

MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度(5、10、20、40、80和160 μmol/L)的luteolin對肺癌A549細胞存活力產(chǎn)生明顯影響。隨著luteolin給藥劑量的增加和作用時間的延長，luteolin對肺癌A549細胞的生長抑制率顯著上升(P<0.05)，見圖1。 Luteolin作用肺癌A549細胞24 h的IC50為68.79 μmol/L，48 h的IC50為47.86 μmol/L。

2 肺癌A549細胞EMT模型的建立

在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，實驗結(jié)果表明，與未經(jīng)TGF-β1處理的對照組細胞比較，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細胞24 h后，其細胞形態(tài)由多邊形向成纖維樣細胞形態(tài)改變，見圖2A。Western blot法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細胞24 h后，EMT分子標志物E-cadherin蛋白表達水平顯著下調(diào)，而vimentin蛋白分子表達顯著上調(diào) (P<0.01)，見圖2B。

Figure 1.The effects of luteolin on the viability of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度的木犀草素對肺癌A549細胞活力的影響

Figure 2.TGF-β1 induced EMT in routinely cultured lung cancer cell line A549. A： the morphological changes of A549 cells observed under microscope (scale bar=50 μm); B: the protein expression of E-cadherin and vimentin determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 TGF-β1誘導(dǎo)細胞EMT模型的建立

3 木犀草素抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞侵襲

Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1作用肺癌A549細胞后，肺癌A549細胞的侵襲能力較未經(jīng)TGF-β1作用組處理的細胞顯著增強 (P<0.01)；但是，與TGF-β1作用組細胞相比，隨著luteolin濃度的增加，肺癌A549細胞的侵襲能力顯著下降(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The invasion ability of A549 cells treated with luteolin was examined by Transwell assay. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.

圖3 Transwell小室法檢測木犀草素對肺癌A549細胞侵襲能力的影響

4 木犀草素逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞EMT

經(jīng)TGF-β1刺激24 h的肺癌A549細胞，在顯微鏡觀察下由多邊形向成纖維樣細胞形態(tài)改變，而加入luteolin作用后，其細胞形態(tài)向多邊形改變，見圖4A。 Western blot法檢測luteolin對EMT標志物E-cadherin和Vimentin的影響，實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1作用組顯著下調(diào)肺癌A549細胞E-cadherin 蛋白表達水平，同時上調(diào)vimentin蛋白表達水平(P<0.01)；然而，加入不同濃度的luteolin處理后，與TGF-β1作用組相比較，肺癌A549細胞E-cadherin 蛋白表達水平上調(diào)，而vimentin蛋白表達水平下調(diào)(P<0.01)，見圖4B。

討 論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤。晚期肺癌患者的預(yù)后與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，便在肺癌的治療中就非常棘手。肺癌的轉(zhuǎn)移受多種因素的影響，其具體機制仍不清楚。EMT與腫瘤細胞的侵襲和遷移過程有著密切的聯(lián)系。近年來針對EMT抑制劑的研究已成為抗癌藥物研究的重要方向。

木犀草素是從天然植物中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性。Luteolin對不同的腫瘤如肝癌[3]、胃癌[6]、前列腺癌[4]和肺癌[5]等發(fā)揮抗癌作用。文獻報道的抗腫瘤作用機制復(fù)雜，如luteolin通過抑制MAPK和PI3K信號通路抑制胃癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。Luteolin發(fā)揮抗腫瘤作用與免疫調(diào)節(jié)以及抑制血管生成有關(guān)[9]。文獻報道，luteolin可增加抗癌藥物的敏感性，降低腫瘤細胞多藥耐藥[10-11]。最近研究顯示， 木犀草素通過抑制Notch信號通路逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生，從而有效抑制胃癌生長[12]；木犀草素通過逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[13]。由此可見，抑制EMT的發(fā)生作為一種新的抗腫瘤機制，通過阻止癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移在胃癌和乳腺癌等多種癌癥中已被證實。然而，luteolin對肺癌EMT影響的文獻報道較少，生長因子例如HGF、EGF和TGF均可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，尤其是TGF-β1誘導(dǎo)腫瘤細胞的EMT作用為較明顯，因此，本文將重點闡述luteolin對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞EMT的影響。

Figure 4.Morphological changes of A549 cells after luteolin treatment and the protein levels of E-cadherin and vimentin in TGF-β1-induced A549 cells treated with luteolin. A： the morphological changes of A549 cells observed under microscope (scale bar=50 μm)； B： the protein expression of E-cadherin and vimentin determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.

圖4 木犀草素對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞形態(tài)變化和EMT相關(guān)蛋白E-cadherin及vimentin表達水平的影響

當腫瘤細胞發(fā)生EMT后，其細胞表型發(fā)生改變，例如，促進細胞間黏附的上皮表型標志蛋白E-cadherin表達下調(diào)，促進腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的間充質(zhì)表型標志蛋白vimentin表達逐漸增高，從而使細胞的遷移和侵襲能力增強[14-15]。因此，阻斷EMT的發(fā)生是限制腫瘤細胞擴散的有效治療方法。本研究首先通過TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細胞建立EMT模型，結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1處理后大部分細胞形態(tài)由多邊形向成纖維樣細胞形態(tài)改變；同時，EMT相關(guān)的標志蛋白， E-cadherin蛋白表達水平下調(diào)，vimentin蛋白表達水平上調(diào)，與細胞形態(tài)的變化結(jié)果相一致。Luteolin可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞EMT的發(fā)生，不僅從形態(tài)學(xué)上使其恢復(fù)上皮細胞的不規(guī)則多邊形，其EMT相關(guān)蛋白 E-cadherin和vimentin 表達均得到逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果和張彥兵等[2]報道白花蛇舌草總黃酮對TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細胞EMT具有逆轉(zhuǎn)作用中的EMT模型結(jié)果相符。經(jīng)歷EMT的細胞最重要的行為改變是細胞侵襲能力的增強，本研究結(jié)果顯示，TGF-β1組A549細胞穿過人工基膜的細胞數(shù)較對照組顯著增多，細胞侵襲率增加，說明發(fā)生EMT使肺癌A549細胞的侵襲能力增強，而luteolin處理可使細胞侵襲率顯著降低，表明luteolin可以抑制肺癌A549細胞EMT引起的細胞侵襲能力增強。這可能與上皮細胞因子E-cadherin 表達增多有關(guān)，因為E-cadherin使細胞間相互黏附聚集，不易向遠處擴散。

綜上所述，本實驗通過細胞形態(tài)的改變及EMT標志蛋白的變化初步表明luteolin作為一種天然存在的化合物可逆轉(zhuǎn)由TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞的EMT，為luteolin在肺癌中的應(yīng)用提供了參考資料。