張建春，吳接呈，張筑宏，王蘭英，駱焱平

(海南大學(xué) 植物保護學(xué)院，?？?570228)

刺芫荽(EryngiumfoetidumL.)別名野香菜、刺芹、洋芫荽等，為傘形科刺芹屬多年生草本植物[1]，在我國主要分布于海南、廣東、廣西、云南等熱帶、亞熱帶地區(qū)[2]，是一種藥蔬兩用植物，具有顯著的消炎、抑菌的功效，極具開發(fā)價值[3]。目前關(guān)于刺芫荽提取物的研究取得了一定進展，如文獻[4]發(fā)現(xiàn)刺芫荽水煎劑具有局部抗炎作用和鎮(zhèn)痛作用；文獻[5]發(fā)現(xiàn)刺芫荽的己烷提取物也具有的抗炎活性，并且確定了其主要成分為谷甾醇；文獻[6]發(fā)現(xiàn)刺芫荽新鮮及干燥葉水提物還能抑制蛇、蝎毒液對紅細胞的溶血作用。文獻[7]發(fā)現(xiàn)刺芫荽水提物對多種細菌有一定的抑制作用，其中，對白喉桿菌的作用較消炎散結(jié)片強。文獻[8]發(fā)現(xiàn)刺芫荽葉提取物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有較好的抑制作用[8]。文獻[9]發(fā)現(xiàn)刺芫荽對胸膜炎模型大鼠炎性細胞因子的影響，說明其治療感染性疾病的作用不單純在于抗菌，而可能對復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)進行協(xié)調(diào)。可見刺芫荽提取物具備多種功效，備受科研者的廣泛關(guān)注。本研究擬通過對刺芫荽葉乙醇提取物的總多酚、總黃酮的含量，對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用以及對高價鐵離子還原能力的測定來評價刺芫荽的抗氧化活性，以期為刺芫荽開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑 刺芫荽提取物(刺芫荽采自海南省五指山地區(qū))；蘆丁、沒食子酸和叔丁基對苯二酚(TBHQ)均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 提取物的制備 將采集的刺芫荽葉洗凈，室內(nèi)自然陰干，碾碎，稱質(zhì)量后加入95%無水乙醇中，避光浸提3 d。抽濾，得到濾液。濾渣在相同條件下再浸提1次，合并濾液，減壓濃縮，得到浸膏，置于室溫陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 提取物總多酚含量的測定 參照文獻[10]的方法測定，略有改動。用95%無水乙醇配制1 g·L-1的乙醇提取物樣品，移取1 mL樣品液于試管中，加入0.5 mL 福林-薛卡多(Folin-Ciocalteu)試劑和5 mL蒸餾水，充分混勻，在室溫下反應(yīng)5 min。再向試管中加入1 mL 5%碳酸鈉溶液，混勻，室溫下黑暗處理60 min。在760 nm處測定樣品的吸光值，實驗重復(fù)3次。以沒食子酸(60，40，20，10，5，2.5 μg·mL-1)為標準樣品繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算提取物的總多酚含量。

1.4 提取物總黃酮含量的測定 參照文獻[11]的方法，略有改動進行測定。用95%的乙醇配制1 g·L-1的乙醇提取物樣品，移取0.5mL樣品液于試管中，加入0.1 mL 10%氯化鋁溶液、0.1 mL醋酸鉀溶液、4.3 mL蒸餾水，充分混勻，室溫下孵育30 min。在415 nm下測定樣品液的吸光值，實驗重復(fù)3次。以蘆丁(0.32，0.16，0.08，0.04，0.02，0.01 g·L-1)為標準樣品繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算提取物的總黃酮含量。

1.5 提取物對DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[12]方法進行，略有改動進行測定。將樣品溶液稀釋為1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 g·L-1。取3.5 mL 2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)溶液于試管中，向試管中加入0.5 mL不同濃度的樣品溶液，充分搖勻，在室溫下孵育30 min，在517 nm下測定的吸光度為A。用0.5 mL 95%無水乙醇代替樣品溶液與3.5 mL DPPH溶液加入試管，測其吸光度為A1；用0.5 mL雙蒸水代替樣品液與3.5 mL的無水乙醇混合，同時以其作為空白對照，測95%無水乙醇和雙蒸水的吸光度為A0。將蘆丁稀釋成與樣品相同濃度的標準溶液作為陽性對照，代替樣品進行上述實驗，每組重復(fù)3次試驗。并計算樣品對DPPH自由基的清除率以及半數(shù)清除作用濃度IC50值。按以下公式計算：

式中：A為樣品溶液和DPPH溶液的平均吸光度；A0為95%無水乙醇和雙蒸水的平均吸光度；A1為95%無水乙醇和DPPH溶液的平均吸光度。

1.6 提取物對羥自由基(·OH)清除能力的測定 參照芬頓(Fenton)反應(yīng)[13]的方法，略有改動。將樣品溶液稀釋為0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0.05 g·L-1。取300 μL樣品溶液于試管中，依次加入1 mL 1.5 mmol·L-1硫酸鐵溶液、0.7 mL 6 mmol·L-1過氧化氫溶液和1.2 mL 6 mmol·L-1水楊酸鈉溶液，充分搖勻。37℃反應(yīng)5 min，在510 nm下測定樣品的吸光度為A1；用雙蒸水代替樣品液作空白對照，按同樣步驟測吸光度為A0。每個處理重復(fù)3次，分別求吸光度平均值。以特丁基對苯二酚(TBHQ)作陽性對照，重復(fù)上述實驗步驟。按以下公式計算：

式中：A0為空白對照平均吸光度；A1為加樣品的平均吸光度；

1.7 提取物對高價鐵離子還原能力的測定 參照文獻[14]的方法，略有改動。取100 μL樣品溶液于試管中，加入3 mL FRAP溶液[25 mL 300 mmol·L-1醋酸鹽緩沖溶液、2.5 mL 0.01 mol·L-1三吡啶三嗪(TPTA)溶液、2.5 mL 0.02 mol·L-1六水合三氯化鐵溶液]，充分搖勻。37 ℃反應(yīng)30 min，在59 3nm測定樣品的吸光度。七水合硫酸亞鐵代替樣品液，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度：0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 5 g·L-1，重復(fù)上述實驗。每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次，求吸光度平均值，并繪制標準曲線。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差 (Mean±SD) , 采用spss22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，采用excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的總多酚含量測定 以沒食子酸標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，反應(yīng)液的吸光度為縱坐標，擬合回歸方程為y=0.005 6x+0.125 1，相關(guān)系數(shù)R2為0.981。表明沒食子酸在質(zhì)量濃度為0～80 mg·L-1范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于刺芫荽葉乙醇提取物總多酚的定量測定。測得刺芫荽葉乙醇提取物為1 g·L-1時總多酚相對超純水吸光度平均值為0.255，由上述方程計算該樣品的總多酚含量為1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當(23.2±0.01)μg的沒食子酸標準品 。

2.2 提取物的總黃酮含量測定 以蘆丁為參比標準來衡量提取物中黃酮類化合物的含量，以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標，505 nm處的吸光值為縱坐標繪制標準曲線，擬合回歸方程為y=0.797x+0.162 3，相關(guān)系數(shù)R2為0.974 1，說明方程相關(guān)性好。測定0.5 g·L-1提取物的吸光值為0.541，由上述方程計算該提取物的總黃酮含量為1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當于(0.96±0.02)μg的蘆丁純品。

2.3 提取物對DPPH自由基的清除能力測定 測定刺芫荽葉乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力見圖1，由圖1可見，該提取物在0.1～1 g·L-1濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基有較強的清除作用，且清除率隨濃度的增大而升高。計算其回歸方程為y=1.288 6x+5.410 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.916，對DPPH自由基清除作用半抑制濃度(IC50)為0.48 g·L-1。同時測得蘆丁回歸方程為y=1.244 9x+5.741，相關(guān)系數(shù)R2為0.887，計算蘆丁的半抑制濃度(IC50)為0.25 g·L-1。刺芫荽葉乙醇提取物對DPPH自由基清除作用稍弱于蘆丁標準品。

圖1 提取物及蘆丁溶液DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging rate of extract and rutin圖2 提取物及TBHQ溶液羥基自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate of extract and TBHQ

2.4 提取物對羥自由基(·OH)清除能力的測定 以2-叔丁基對苯二酚(TBHQ)為陽性對照，測定刺芫荽葉乙醇提取物對羥自由基的清除作用(圖2)。由圖2可見，在0.05～0.8 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加該提取物對羥自由基的清除作用逐漸增強。計算回歸方程為y=0.749 7x+5.276 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.936，對羥自由基清除作用半抑制濃度(IC50)為0.43 g·L-1。同時計算TBHQ標準品回歸方程為y=0.998 1x+5.553 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.917，對羥自由基清除作用半抑制濃度(IC50)為0.28 g·L-1。相比之下，刺芫荽葉乙醇提取物對羥自由基的清除活性低于TBHQ標準品。

2.5 提取物對高價鐵離子的還原能力測定 以FeSO4質(zhì)量濃度為橫坐標，593 nm處吸光值為縱坐標，擬合回歸方程為y=1.778 8x+0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2為0.973。測得刺芫荽葉乙醇提取物為1 mg·mL-1時還原鐵的相對超純水吸光度平均值為0.358，由上述方程計算該樣品還原鐵的含量為1 mg提取物干粉的還原力相當于0.72 mmol·L-1的七水合硫酸亞鐵。由此可見該提取物具有很好的高價鐵離子的還原能力。

3 討 論

本研究采用乙醇對刺芫荽葉進行浸提，測定了該提取物的總多酚含量、總黃酮含量以及對DPPH自由基、羥自由基的清除作用和高價鐵離子的還原能力。結(jié)果表明：1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當(23.2±0.01)μg的沒食子酸標準品；1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當于(0.96±0.02)μg的蘆丁純品；1 mg提取物干粉的還原力相當于0.72 mmol ·L-1的七水合硫酸亞鐵；提取物對DPPH自由基和羥自由基的清除率低于對照的藥劑?？傮w來看，提取物抗氧化活性較好。這一結(jié)論驗證了劉志東[15]等人提出刺芫荽是天然抗氧化劑的重要來源這一觀點。

自由基的清除是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機理[16]。大量研究結(jié)果證明，刺芫荽全株含豆甾醇類物質(zhì), 嫩葉富含十二碳烯醛、十四烯醛、十二醛、月桂酸等多種芳香物質(zhì)，如高燕等研究發(fā)現(xiàn)2-十二碳烯醛是刺芫荽特征香氣的主要成分，具有柑橘和脂肪氣味[17]。JAN BANOUT等的研究也證明了刺芫荽水提取物中2-十二碳烯醛是主要成分，其次是正十二烷醛，2-十四烯醛和1-十四烯[18]。本研究尚未對提取物成分進行分析，在后續(xù)研究中尋找清除自由基的物質(zhì)是追蹤刺芫荽抗氧化作用機理的關(guān)鍵。