羅春萍 胡純秋

(1 臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318020；2 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，安徽 合肥 230032)

花生是一種營(yíng)養(yǎng)豐富且深受人們喜愛的食物，也是世界公認(rèn)的八大過敏原食物之一[1]。近年來(lái)的流行病學(xué)研究表明，花生過敏影響了1%～2%的世界人口，各國(guó)花生過敏人數(shù)呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，花生過敏反應(yīng)的危害性和長(zhǎng)期性已嚴(yán)重影響了花生過敏人群的生活質(zhì)量[2-4]。Ara h 2蛋白是花生致敏性最強(qiáng)的組分之一，由分子量為16.7 kDa和18 kDa的2個(gè)亞型蛋白組成，約占花生蛋白總量的5.9%～9.3%[5-6]。過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是表位，表位可分為線性表位和構(gòu)象性表位，線性表位由5～7個(gè)連續(xù)氨基酸組成，構(gòu)象性表位可由分布于肽鏈不同部位或不同肽鏈的15～22個(gè)氨基酸構(gòu)成，與蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象密切相關(guān)[7]。在Ara h 2的空間折疊結(jié)構(gòu)中，5個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成基本骨架，并以4個(gè)保守的二硫鍵連接α-螺旋結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定構(gòu)象，對(duì)過敏原構(gòu)象性表位的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用[8]。此外，Ara h 2.01含有10個(gè)過敏原線性表位，Ara h 2.02比Ara h 2.01多一個(gè)DPYSPS的線性表位，它們能與花生過敏患者血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合，引發(fā)致敏反應(yīng)[8-9]。

輻照技術(shù)作為一項(xiàng)常用的食品非熱加工技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于食品保藏、品質(zhì)改善、消毒滅菌等方面[10]。近年來(lái)，利用輻照對(duì)過敏食品進(jìn)行脫敏的技術(shù)也受到了廣泛關(guān)注[11]。研究發(fā)現(xiàn)，輻照能引起蛋白質(zhì)氨基酸序列的斷裂、交聯(lián)和分子構(gòu)象的改變，導(dǎo)致過敏原表位的破壞，進(jìn)而影響過敏原與相應(yīng)抗體的結(jié)合能力，改變過敏原的致敏性，有可能成為降低或消除食物過敏反應(yīng)的重要技術(shù)[12-14]。王爍等[15]用60Co-γ輻照處理花生溶液，發(fā)現(xiàn)1.0 kGy以下的小劑量輻照處理對(duì)花生溶液中的致敏蛋白影響不大；當(dāng)輻照劑量在1.0 kGy以上時(shí)，花生各蛋白含量普遍減少，說(shuō)明輻照處理能降低花生的致敏性并與輻照劑量關(guān)系密切。許舒婷等[16]曾用電子束輻照處理花生過敏原液和脫脂花生粉，發(fā)現(xiàn)輻照能較大程度地降低液體狀態(tài)下的花生過敏原致敏性，但對(duì)花生粉中的過敏原影響較小。目前，輻照去除或減少花生過敏原的研究和應(yīng)用尚處于發(fā)展階段[11]，輻照過程中花生過敏原結(jié)構(gòu)與表位的變化規(guī)律和機(jī)理有待深入研究。因此，本研究選取花生過敏原中過敏原表位和三維結(jié)構(gòu)均較明確的 Ara h 2 為試驗(yàn)對(duì)象，評(píng)估60Co-γ輻照處理后Ara h 2蛋白的結(jié)構(gòu)與抗原性變化，探討花生過敏原輻照變化的規(guī)律與機(jī)理，以期為輻照在花生脫敏中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花生，購(gòu)自南昌市青山湖農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；DEAE-Sepharose Fast Flow，美國(guó)GE公司；PVDF膜，美國(guó)Millipore公司；兔抗Ara h 2 多克隆抗體(效價(jià)1∶100 000)，南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制[17]；4-氯-1-萘酚、OPD、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗等，美國(guó)Sigma公司；96孔酶標(biāo)板，深圳金燦華公司。其他試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Ara h 2的過敏原線性表位與α-螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸序列見圖1[8-9]。

圖1 Ara h 2的過敏原線性表位與α-螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸序列Fig.1 Sequence of linear epitopes and α-helix of Ara h 2

1.2 主要儀器與設(shè)備

MA99-1自動(dòng)核酸蛋白分離層析儀，上海青浦滬西儀器廠；60Co-γ輻照源，江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能應(yīng)用研究所；Mini-protean 3蛋白垂直電泳槽、PowerPac 3000電泳儀、Trans-Blot SD Cell電轉(zhuǎn)儀、Mode 1860酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；UV-VS 2501PC紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；J-810圓二色譜儀，日本JASCO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生過敏原Ara h 2的分離純化 參照胡純秋[17]的方法。新鮮花生仁研磨成粉末，用丙酮脫脂，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值7.2)浸提得花生蛋白溶液。將花生蛋白溶液過DEAE-Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱分離，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值7.2)為淋洗液，得到花生過敏原Ara h 2溶液，再將Ara h 2溶液用Amicon Ultra-15超濾離心管(截留分子量3.0 kDa)濃縮，-20℃保存?zhèn)溆?。采用SDS-PAGE電泳對(duì)Ara h 2溶液的純度及分子量進(jìn)行分析檢測(cè)，并用Bradford法測(cè)定Ara h 2溶液的濃度。

1.3.2 花生過敏原Ara h 2蛋白濃度的測(cè)定 采用Bradford法[18]測(cè)定Ara h 2蛋白濃度，并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)波長(zhǎng)為595 nm。

1.3.3 輻照處理 輻照處理在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能應(yīng)用研究所進(jìn)行，將純化的Ara h 2溶液用50 mmol·L-1、Tris-HCl緩沖液(pH值7.2)稀釋成0.2 mg·mL-1，每管40 mL分裝密封于離心管中，然后采用60Co-γ輻照裝置于室溫(25℃左右)下進(jìn)行輻照處理，輻照劑量分別為0、1、3、5、10、15、20、25 kGy，劑量率為8.65 Gy·min-1。每個(gè)劑量設(shè)3次重復(fù)，輻照后所有樣品立即儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆?，檢測(cè)也均重復(fù)3次。

1.3.4 輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白結(jié)構(gòu)的影響 取適量0.2 mg·mL-1Ara h 2蛋白溶液，于室溫(25℃左右)條件下，采用紫外分光光度計(jì)分析Ara h 2蛋白的結(jié)構(gòu)。波長(zhǎng)掃描范圍為190～400 nm、間隔1 nm、掃描速度為100 nm·min-1。

1.3.5 輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 取適量0.2 mg·mL-1Ara h 2蛋白溶液，于室溫(25℃左右)、氮?dú)獯祾邨l件下，采用圓二色譜儀測(cè)定Ara h 2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。遠(yuǎn)紫外波長(zhǎng)掃描范圍為190～250 nm，間隔1 nm，掃描速度為100 nm·min-1，光徑為1 mm。每個(gè)樣品圓二檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。測(cè)定結(jié)果用氨基酸殘基摩爾橢圓率(mean residue ellipticity，MRE，[θ])表示，單位為deg·cm2·dmol-1，按照下列公式計(jì)算[19]：

[θ]=θλ×(M/氨基酸殘基數(shù))/(C×L)

(1)

式中，θλ為CD觀察值，mdeg；M為蛋白質(zhì)分子量；C為蛋白濃度，mg·mL-1；L為光徑，mm。

1.3.6 輻照處理對(duì)Ara h 2分子量的影響 將輻照處理前后的Ara h 2溶液與2×上樣緩沖液等體積混合制成電泳樣品，100℃煮沸離心后上樣。SDS-PAGE電泳采用不連續(xù)體系，使用15%分離膠和5%濃縮膠；恒流電泳：濃縮膠6 mA恒流20 min，分離膠12 mA恒流。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并用數(shù)碼相機(jī)拍照，備用。

1.3.7 輻照處理對(duì)Ara h 2抗原性的影響 1)免疫印跡法。輻照處理前后的Ara h 2 蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)條件：室溫條件下50 mA恒流電轉(zhuǎn)2 h。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用1% TBST溶液(含1%吐溫-20的TBS溶液)室溫振蕩封閉1 h，TBS (含50 mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1NaCl，pH 值7.5)洗滌3次后加入兔抗Ara h 2 血清(1∶5 000 TBS稀釋)，4℃反應(yīng)過夜。次日取出PVDF膜，TBS洗滌3次后加HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG二抗(1∶5 000 TBS稀釋)，室溫振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，TBS洗滌PVDF膜3次，加入4-氯-1-萘酚顯色液(含20 mL TBS、12 mg 4-氯-1-萘酚、4 mL乙醇、12 μL 30% H2O2)室溫避光顯色。待出現(xiàn)明顯條帶后，蒸餾水終止反應(yīng)，并用濾紙吸干，數(shù)碼相機(jī)拍照并保存結(jié)果。以普通兔血清代替兔抗Ara h 2 血清作為陰性對(duì)照，以排除假陽(yáng)性反應(yīng)。

2)間接ELISA法。將輻照處理前后的Ara h 2溶液用包被液(含15 mmol·L-1Na2CO3、35 mmol·L-1NaHCO3，pH值9.6)稀釋成1.25 μg·mL-1，在同一酶標(biāo)板上每孔包被100 μL，每個(gè)樣品包被3個(gè)孔，4℃包被過夜。次日取出酶標(biāo)板，用PBST(含1%吐溫-20的100 mmol·L-1pH值7.0磷酸鹽緩沖液)，每孔250 μL洗滌3次后，加入5%脫脂乳封閉液(PBS稀釋)，每孔250 μL，37℃恒溫封閉1 h。PBST洗滌后加入兔抗Ara h 2血清(1∶10 000 PBS稀釋)，每孔100 μL，37℃恒溫反應(yīng)1 h。洗滌后加入HRP酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000 PBS稀釋)，每孔100 μL，37℃恒溫反應(yīng) 1 h。反應(yīng)結(jié)束后，PBST再洗滌3次，加入OPD顯色液[含0.5 mg·mL-1OPD、0.03%H2O2、100 mmol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH值5.5)]，每孔100 μL，37℃恒溫避光顯色15 min，2 mol·L-1H2SO4溶液(每孔50 μL)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm處的OD值，并計(jì)算不同劑量輻照處理后的IgG結(jié)合能力：

IgG結(jié)合能力=B/B0×100%

(2)

式中，B0為0 kGy輻照處理樣品OD490值；B為輻照處理樣品OD490值。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2010對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析，并采用SPSS 18.0軟件檢驗(yàn)組間差異顯著性，P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理對(duì)Ara h 2 蛋白結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，未輻照(0 kGy)組Ara h 2蛋白有2個(gè)吸收峰，分別在210 nm和275 nm處，其中210 nm處的吸收峰主要是由Ara h 2肽鍵上C=O的n→π*躍遷引起的，與Ara h 2肽鍵C=O含量有關(guān)。Ara h 2分子中含有1個(gè)色氨酸(Trp)和4～5個(gè)酪氨酸(Tyr)(圖1)[8-9]，色氨酸和酪氨酸芳香環(huán)的π→π*和n→π*躍遷是引起Ara h 2蛋白275 nm處吸收峰的主要原因[20]。輻照處理后，210 nm和275 nm處的吸收峰均出現(xiàn)顯著增色效應(yīng)，且輻照劑量越大，強(qiáng)度越強(qiáng)。210 nm處峰位向高波數(shù)微小位移(紅移)，275 nm峰位略向低波數(shù)位移(藍(lán)移)，表明輻照處理可使Ara h 2蛋白肽鏈伸展，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸殘基暴露，顯示為275 nm處的吸收峰增強(qiáng)，且隨著輻照劑量的增加，酪氨酸和色氨酸殘基暴露的越多，對(duì) Ara h 2 蛋白的影響也越大；同時(shí)暴露出來(lái)的酪氨酸和色氨酸具有疏水性，使蛋白分子之間疏水作用增強(qiáng)，π→π*和n→π*躍遷能量增大，導(dǎo)致峰位向低波數(shù)微小位移，可見輻照處理使Ara h 2發(fā)生了構(gòu)象改變。此外，210 nm處吸收峰的增強(qiáng)說(shuō)明了Ara h 2蛋白羰基含量的增加，輻照過程中產(chǎn)生的羥基自由基易作用于側(cè)鏈帶有-NH和-NH2的氨基酸[21]，使其發(fā)生脫氨反應(yīng)產(chǎn)生羰基，而羰基碳原子與羥基自由基相連則使該吸收峰輕微紅移。

圖2 不同劑量輻照處理下Ara h 2蛋白的紫外光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of Ara h 2 protein under different doses of irradiation treatment

2.2 輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜(circular dichroism，CD)是研究溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的方法[22]。190～250 nm的遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)，圓二色性主要由肽鍵的n→π*電子躍遷引起，能夠反映蛋白質(zhì)或多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息[23]。由圖3可知，CD顯示了天然Ara h 2蛋白在195 nm處有一個(gè)正峰，208 nm和222 nm各有一個(gè)負(fù)峰，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的3個(gè)特征峰[24]，即 Ara h 2 具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這與Mueller等[9]的研究結(jié)果相符。隨著輻照劑量的增加，208、222 nm處負(fù)峰均減弱，并略向低波數(shù)移動(dòng)，可見α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少。這是因?yàn)檩椪债a(chǎn)生的自由基作用于Ara h 2蛋白，引起肽鍵C=O的n→π*躍遷，破壞維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵和二硫鍵，使規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鍵排列的方向改變，從而引起Ara h 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。當(dāng)輻照劑量達(dá)到10、15 kGy時(shí)，195 nm正峰和208、222 nm負(fù)峰均相當(dāng)薄弱，直至20、25 kGy輻照處理后，Ara h 2 蛋白的CD光譜峰接近消失，α-螺旋結(jié)構(gòu)幾乎消失，表明10、15、20、25 kGy輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了極大的破壞。

圖3 不同劑量輻照處理下Ara h 2 蛋白的圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra of Ara h 2 protein under different doses of irradiation treatment

由圖4可知，Ara h 2蛋白經(jīng)輻照引起的α-螺旋結(jié)構(gòu)208 nm特征峰的強(qiáng)度減弱，與UV 275 nm的峰強(qiáng)度增強(qiáng)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.921，表明α-螺旋含量的減少與酪氨酸、色氨酸殘基的暴露呈正相關(guān)。綜上，在輻照過程中Ara h 2蛋白的結(jié)構(gòu)變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。

圖4 不同劑量輻照處理下Ara h 2蛋白的圓二色譜與紫外光譜的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between circular dichroism spectra and UV absorption spectra of Ara h 2 protein under different doses of irradiation

2.3 輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白分子量的影響

由圖5可知，天然Ara h 2蛋白的分子量為16、18 kDa，這與Marsh等[25]的報(bào)道一致。輻照處理后花生Ara h 2蛋白條帶發(fā)生了顯著變化，16 kDa和18 kDa蛋白條帶顏色隨著輻照劑量的增加而變淺，且在10 kGy時(shí)條帶消失，同時(shí)Ara h 2蛋白產(chǎn)生了一些高分子量的化合物，多數(shù)聚合物堆積在分離膠的頂部，甚至存在于濃縮膠中，無(wú)法進(jìn)入到分離膠，且1、3 kGy處理出現(xiàn)了部分34 kDa的聚合物。綜上所述，輻照產(chǎn)生的能量能打斷肽鏈，產(chǎn)生蛋白亞基，而這些亞基片斷可能重新交聯(lián)產(chǎn)生了分子量較大的聚合物，即輻照處理使 Ara h 2 蛋白發(fā)生了降解和交聯(lián)。

注：M：預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白。下同。Note: M: Prestained marker. The same as following.圖5 不同劑量輻照處理下Ara h 2 蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of Ara h 2 protein under different irradiation doses

2.4 輻照處理對(duì)Ara h 2抗原性的影響

圖6中泳道2只出現(xiàn)16 kDa和18 kDa 2個(gè)印跡條帶，而陰性兔血清的免疫印跡圖譜上無(wú)任何條帶(結(jié)果未列出)，說(shuō)明Ara h 2抗體能特異性地識(shí)別 Ara h 2 蛋白及其表位，與花生中的其他過敏原均無(wú)反應(yīng)。輻照Ara h 2蛋白免疫印跡圖與電泳圖的一個(gè)明顯變化是，看不到分離膠頂部的印跡條帶，其原因可能是輻照破壞了Ara h 2蛋白的表位，從而在膜上無(wú)法與抗體反應(yīng)，也可能是形成的聚合物分子量過大，無(wú)法從電泳凝膠轉(zhuǎn)印至膜上?？傮w來(lái)說(shuō)，免疫印跡條帶的消失說(shuō)明輻照處理可以破壞Ara h 2蛋白與兔抗Ara h 2蛋白多克隆抗體(IgG)結(jié)合的活性。

圖6 不同劑量輻照處理下Ara h 2蛋白的免疫印跡圖Fig.6 Western blotting of Ara h 2 protein under different irradiation doses

為進(jìn)一步檢測(cè)輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白免疫活性的影響，采用間接ELISA方法定量測(cè)定輻照處理后Ara h 2蛋白與Ara h 2抗體的結(jié)合能力(圖7)。結(jié)果表明，隨著輻照劑量的增大，Ara h 2蛋白與抗體的結(jié)合能力降低，當(dāng)輻照劑量為5 kGy時(shí)，Ara h 2蛋白的IgG結(jié)合能力降低了66%；輻照劑量為10～25 kGy時(shí)，Ara h 2蛋白的IgG結(jié)合能力均降至10%以下，這與免疫印跡得到的結(jié)果一致，說(shuō)明輻照處理破壞了Ara h 2蛋白的表位，使其失去與抗體結(jié)合的能力；輻照劑量為5 kGy時(shí)可較大程度破壞Ara h 2蛋白表位，10～25 kGy輻照處理后Ara h 2蛋白基本喪失免疫活性。此外，輻照劑量增大引起的Ara h 2的抗原性減弱與CD 208 nm峰強(qiáng)度的降低有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.842。同時(shí)，比較Ara h 2的抗原性減弱與UV 275 nm的峰強(qiáng)度增強(qiáng)的趨勢(shì)，得出兩者相關(guān)系數(shù)為0.961，相關(guān)度更高，說(shuō)明輻照處理使Ara h 2蛋白的有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為無(wú)序，引起過敏原表位無(wú)法與Ara h 2抗體結(jié)合，失去免疫活性。

圖7 不同輻照劑量下Ara h 2的IgG結(jié)合能力與Ara h 2 α-螺旋含量變化Fig.7 Changes of IgG binding abilities and α-helix content of Ara h 2 protein under different irradiation doses

3 討論

3.1 輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白構(gòu)象的影響

在液體狀態(tài)下60Co輻照產(chǎn)生的γ射線激活水分子產(chǎn)生水合電子、羥基和氫基自由基作用于氨基酸、多肽等生物分子，使它們發(fā)生脫氨、脫羧、氧化反應(yīng)，引起蛋白質(zhì)降解、交聯(lián)和分子構(gòu)象的改變，是輻照引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要原因[26-27]。輻照處理后Ara h 2蛋白在210、275 nm處的紫外吸收強(qiáng)度的顯著變化及208、222 nm處圓二色光譜的改變，表明蛋白質(zhì)肽鍵、色氨酸、酪氨酸殘基都是輻照自由基對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行攻擊的位置，這種攻擊導(dǎo)致了Ara h 2蛋白發(fā)生聚合作用和片段化，顯示為輻照強(qiáng)度增強(qiáng)的條件下，分子量為16 kDa和18 kDa的條帶幾乎消失，并出現(xiàn)大分子聚合物。

胡欣欣[28]發(fā)現(xiàn)在較多羥基自由基存在的條件下，酪氨酸易被氧化為二聚酪氨酸，使蛋白分子發(fā)生集聚。Ara h 2蛋白分子具有較多的酪氨酸，其水溶液經(jīng)輻照處理后產(chǎn)生的羥基使Ara h 2蛋白出現(xiàn)降解和交聯(lián)現(xiàn)象，且輻照強(qiáng)度增強(qiáng)時(shí)Ara h 2蛋白在275 nm處的特征峰顯著增強(qiáng)，故可推測(cè)Ara h 2蛋白在輻照過程中形成聚合物的主要原因可能是因?yàn)樾纬闪硕劾野彼帷?/p>

3.2 輻照處理對(duì)Ara h 2蛋白致敏活性的影響

蛋白質(zhì)引起致敏的前提是其具有抗原性。本研究結(jié)果表明，隨著輻照劑量的增大，Ara h 2蛋白與抗體的結(jié)合能力降低，說(shuō)明輻照能破壞Ara h 2蛋白的抗原性，降低蛋白質(zhì)的致敏性，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在 Ara h 6 和其他花生過敏原蛋白中[16,29]。此外，Byun等[30]、Meng等[31]也證實(shí)輻照能破壞蝦原肌球蛋白、雞蛋卵白蛋白、牛奶β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的過敏原表位，導(dǎo)致致敏性的消減。

過敏原表位是蛋白質(zhì)具有抗原性的關(guān)鍵性因素，是抗原與抗體特異性識(shí)別的基本單位。Ara h 2蛋白具有10～11個(gè)線性過敏原表位，Barre等[8]和Mueller等[9]發(fā)現(xiàn)色氨酸和酪氨酸均位于Ara h 2 蛋白分子的過敏原表位上，α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)Ara h 2 蛋白表位功能的發(fā)揮起著重要的作用。通過紫外光譜和圓二色光譜分析發(fā)現(xiàn)，輻照處理引起了Ara h 2蛋白色氨酸、酪氨酸殘基和α-螺旋含量的變化，這些變化均與Ara h 2蛋白與抗體結(jié)合能力的降低呈現(xiàn)高度的相關(guān)性，說(shuō)明輻照處理導(dǎo)致了Ara h 2蛋白變性、交聯(lián)和構(gòu)象的改變，破壞了其過敏原表位，導(dǎo)致蛋白抗原性降低，破壞蛋白質(zhì)本身的致敏性。

3.3 輻照劑量對(duì)Ara h 2構(gòu)象及致敏活性的影響

本研究中，當(dāng)輻照劑量達(dá)到10 kGy時(shí)，溶液中 Ara h 2 蛋白的結(jié)構(gòu)基本已被破壞，幾乎喪失了與抗體結(jié)合的能力，而繼續(xù)增加輻照劑量，其結(jié)構(gòu)與抗原性的改變均不顯著，即輻照劑量為10 kGy時(shí)就能達(dá)到有效破壞Ara h 2蛋白結(jié)構(gòu)和致敏活性的目的。同樣， Ara h 6 蛋白在輻照劑量達(dá)到10 kGy時(shí)其在溶液中與抗體結(jié)合的能力也基本消失[29]。許舒婷等[16]發(fā)現(xiàn)電子束輻照可以降低混合花生蛋白提取液的致敏性，Ara h 2 蛋白條帶在輻照劑量達(dá)到15 kGy時(shí)完全消失，其他蛋白條帶也均明顯變淺，而在劑量達(dá)到20 kGy時(shí)，脫脂花生粉末的致敏性才開始降低。因此，下一步研究的重點(diǎn)應(yīng)是綜合考慮花生過敏原的存在狀態(tài)等因素，在控制輻照劑量的同時(shí)最大限度地降低花生過敏原的致敏性。

4 結(jié)論

60Co-γ輻照處理可顯著改變?nèi)芤褐谢ㄉ^敏原Ara h 2蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原性，使其在275 nm處的紫外吸光度增強(qiáng)，α-螺旋含量降低，并形成蛋白交聯(lián)。隨著輻照劑量的增加，Ara h 2蛋白與抗體的結(jié)合能力降低，且輻照處理后Ara h 2蛋白的結(jié)構(gòu)變化與其抗原性變化是高度相關(guān)的，說(shuō)明輻照處理改變了蛋白質(zhì)的特定氨基酸或肽鍵的組成，導(dǎo)致Ara h 2蛋白變性，破壞了蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合能力，降低了蛋白質(zhì)的致敏性。此外，輻照劑量為10 kGy時(shí)可基本破壞溶液中Ara h 2蛋白的免疫活性。綜上，輻照處理能降低花生過敏原的致敏性，可作為花生過敏原脫敏的新方法，但要達(dá)到良好的輻照脫敏效果并開展實(shí)際應(yīng)用，仍需進(jìn)一步深入研究。