趙 金 潘道東 孫楊嬴 曹錦軒 曾小群
(寧波大學食品與藥學學院/浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室,浙江 寧波 315211)
隨著生活水平的提高,生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的變化,酒精濫用現(xiàn)象越來越普遍[1]。由此引發(fā)的酒精性脂肪肝是酒精性肝病的早期病變階段[2],長期過量飲酒會使其加重,轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娴木凭愿窝?、酒精性肝纖維化或酒精性肝硬化[3-4],臨床癥狀為非特異性,可無癥狀或右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體重減輕等[5]。目前,酒精性脂肪肝發(fā)病機制尚不明確,但酒精及其代謝產(chǎn)物導致的脂肪代謝異常、脂質(zhì)過氧化損傷[6]及氧化應(yīng)激[7]等都與之相關(guān)。國內(nèi)外缺少療效顯著的治療藥物,因此,亟需研制出對酒精性脂肪肝具有抑制作用的藥物。
我國被譽為“世界水禽王國”,鵝的飼養(yǎng)量、存欄量、屠宰量均位居世界第一[8]。但鵝副產(chǎn)品肝臟的利用方式仍局限于初級加工,如制成鵝肝醬或肥料[9],經(jīng)濟價值較低。研究表明,禽類肝臟在酶解物中產(chǎn)生大量游離氨基酸、蛋白質(zhì)、有益機體健康的金屬離子及抗氧化肽[10-11],且抗氧化肽分子量多位于10 kDa以下[12]。鵝肝在酶解過程中可以釋放出大量具有生物活性(抗氧化、金屬螯合)的天然小肽[13],其安全性更高,具有較好的研究價值。王立等[10]利用胰酶酶解鵝肝,發(fā)現(xiàn)酶解物具有抗氧化活性。舒沿沿等[13]進一步利用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)混合發(fā)酵制備鵝肝肽,并利用Sephadex G-25凝膠層析分離得到P1、P2、P3三種抗氧化肽。但有關(guān)鵝肝酶解物對酒精引起的脂肪肝的防治效果尚鮮見報道。在前人研究的基礎(chǔ)上,本試驗利用SD大鼠酒精性脂肪肝模型研究鵝肝酶解物體內(nèi)保肝護肝作用,探討鵝肝酶解物對酒精性脂肪肝的改善作用,以期為開發(fā)治療酒精性脂肪肝的藥物提供理論依據(jù)。
SPF級6周齡雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠32只,體質(zhì)量260±10 g,購自Sino-British SIPPR/BK Lab.Animal Ltd(杭州);鵝肝由寧波曙海食品有限公司提供;胃蛋白酶(3 000 NFU·mg-1),北京索萊寶科技有限公司;Lieber-DeCarli 乙醇液體飼料,南京特羅菲飼料科技有限公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)測定試劑盒,北京中生北控生物科技股份有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒,上海源葉生物科技有限公司;總DNA提取試劑盒,美國Omega生物科技有限公司。
PL403 電子天平,梅特勒-托利多公司;XHF-D 高速分散器,寧波新芝生物科技股份有限公司;H1850R 臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;BT3000 全自動生化分析儀,意大利奔騰公司;FD-1D-80 真空冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;Spectar Max 190 酶標儀,美國Molecular Devices 公司。
1.3.1 鵝肝酶解物的制備 獲得的新鮮鵝肝用聚乙烯袋包裝后立即于-20℃冷凍保存。試驗前一天,將鵝肝小塊在2℃的冰箱中過夜解凍。鵝肝酶解物(goose liver hydrolysate,GLH)的制備參考Chou等[12]的方法。將去離子水以1∶2的質(zhì)量比加入解凍后的鵝肝中,均質(zhì)3 min,調(diào)節(jié)pH值至2.0,然后95℃加熱 10 min使肝內(nèi)的內(nèi)源酶變性。冷卻后,鵝肝勻漿液和胃蛋白酶以400∶1的質(zhì)量比混合,于37℃酶解2 h。酶解完成立即將勻漿液加熱至95℃并保持15 min。水解產(chǎn)物在2 000×g、4℃條件下離心15 min,用濾紙過濾上層液體,最后采用真空冷凍干燥機將所得液體凍干成粉,即得到GLH粉末。
1.3.2 動物分組及給藥方法 32只6周齡SD雄性大鼠在室溫22±2℃、相對濕度55%±5%、光照:黑暗=12 h:12 h條件下用標準實驗室飼料飲食適應(yīng)一周后,隨機分成4組,每組8只。其中, 對照組:Lieber-DeCarli液體對照飼料+生理鹽水(灌胃);模型組:Lieber-DeCarli乙醇液體飼料+生理鹽水(灌胃); GLH-H組:Lieber-DeCarli乙醇液體飼料+ 600 mg·kg-1BW GLH(灌胃);GLH-L組:Lieber-DeCarli乙醇液體飼料+ 200 mg·kg-1BW GLH(灌胃)。模型組、GLH-H組、GLH-L組中的大鼠給予足夠飼料,而配對喂養(yǎng)的對照組接受與前一天模型組大鼠相同的飲食量。液體飼料按使用說明現(xiàn)用現(xiàn)配,每天早上9:00進行灌胃,下午5:00點進行液體飼料的替換。用Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)5周,每周記錄一次大鼠體重變化。
1.3.3 標本的采集和處理 在喂養(yǎng)第42天下午 5:00 撤去飼料和水,按照組別收集其糞便(-80℃冰箱保存),然后所有大鼠禁食過夜。第二天采用心尖取血,將收集到的血液于4℃冰箱靜置過夜,3 500 r·min-1離心10 min,取上層血清并保存在-80℃冰箱中,備用。大鼠斷頸處死后進行解剖,取其各組織(肝臟、心臟、腎臟、肺臟和脾臟),用生理鹽水漂洗、濾紙試干稱重后,快速放入液氮中冷凍,待解剖完成后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存,備用。肝臟在試干稱重后分離出一部分,放入體積分數(shù)4%甲醛溶液固定24 h保存,隨后用石蠟包埋切片,應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)法染色[14],光鏡下觀察組織病理學變化。
1.3.4 生化指標的測定 血清中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),總膽固醇(total cholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG)的含量采用全自動生化分析儀進行測定[15]。
1.3.5 炎癥因子的測定 血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)含量的測定均按照相應(yīng)試劑盒的使用說明進行。
1.3.6 腸道微生物的測定 按照Stool DNA Kit的使用說明提取各組樣品中的總DNA,最終將總DNA在50 μL洗脫緩沖液中洗脫并儲存在-80℃冰箱中,隨后委托上海生工進行高通量測序并對各樣品中微生物多樣性進行分析。
1.3.7 數(shù)據(jù)分析 本試驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進行處理,結(jié)果均以均值+標準差表示。組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05表示組間差異性顯著。
對照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝內(nèi)無脂肪變性,肉眼觀察肝臟呈鮮紅色,說明肝內(nèi)沒有明顯的脂肪堆積(圖1-A);模型組肝細胞普遍明顯腫大,具有嚴重脂肪變性現(xiàn)象,核增大,肉眼觀察肝臟顏色呈淡紅色,肝內(nèi)有明顯的脂肪空泡(圖1-C);GLH-L劑量組肝細胞有中度脂肪變性現(xiàn)象(圖1-D);GLH-H高劑量組肝細胞只有較少的脂肪空泡,屬于輕度脂肪變性(圖1-B)。綜上表明,大鼠酒精性脂肪肝模型建立成功,且GLH對酒精性脂肪肝具有明顯的改善作用,高劑量組改善效果優(yōu)于低劑量組。
注:A:對照組;B:GLH-H組;C:模型組;D:GLH-L組。Note: A: Control. B: GLH-H group. C: Model group. D: GLH-L group.圖1 大鼠肝臟HE染色后的病理切片圖(HE,×200)Fig.1 Pathology slice images of mouse liver after HE staining (HE, ×200)
由表1可知,試驗開始時各試驗組大鼠體重無顯著性差異,而試驗結(jié)束時各試驗組大鼠體重差異顯著。與對照組相比,模型組大鼠體重顯著降低(P<0.05),而GLH-L組、GLH-H組大鼠體重均介于對照組和模型組大鼠體重之間,表明在長期飲酒的情況下,大鼠食用相同體積的飼料,酒精會使體重降低。與對照組相比,模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著增大(P<0.05),符合酒精性脂肪肝大鼠的特點[16];與模型組相比,GLH-H組大鼠肝臟指數(shù)顯著減小(P<0.05),GLH-L組大鼠肝臟指數(shù)也有所下降,但無統(tǒng)計學差異。綜上表明,高劑量的GLH可以改善酒精性脂肪肝引起的大鼠體重增長,減緩肝臟指數(shù)增大的癥狀。
表1 GLH對酒精性脂肪肝大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of GLH on body weight and liver index in rats with alcoholic fatty liver
注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Note: Different lowercase letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.
由表2可知,與對照組相比,模型組大鼠血清中尿素氮、總膽固醇和甘油三酯含量顯著增加,與模型組相比,GLH-H 組大鼠血清中尿素氮、總膽固醇和甘油三酯含量均顯著降低;GLH-L組大鼠血清中尿素氮和總膽固醇較模型組大鼠無顯著變化,甘油三酯含量顯著下降。上述結(jié)果說明,只有當GLH劑量足夠高時才能對酒精性脂肪肝大鼠血清學指標具有顯著的改善作用。
由圖2可知,與對照組相比,模型組大鼠血清中各炎癥因子含量均顯著性升高;GLH-H組和GLH-L組大鼠血清中的炎癥因子含量均高于對照組,顯著低于模型組。上述結(jié)果說明,GLH只需要很低的劑量就可以顯著的改善酒精性脂肪肝大鼠血清中的炎癥水平。
表2 GLH對酒精性脂肪肝大鼠血清尿素氮、總膽固醇、甘油三酯的影響Table 2 Effect of GLH on serum BUN, TC and TG in rats with alcoholic fatty liver /(mmol·L-1)
注:不同小寫字母表示不同組別的同一炎癥因子含量差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference in the content of the same inflammatory factor in different groups at 0.05 level.圖2 GLH對酒精性脂肪肝大鼠血清中炎癥因子的影響Fig.2 Effect of GLH on inflammatory cytokine on serum in rats with alcoholic fatty liver
由圖3可知,在門水平上,無論是對照組、模型組、還是GLH-H組、GLH-L組大鼠,其腸道微生物的組成均主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroietes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)。與對照組相比,模型組大鼠腸道微生物中厚壁菌門相對含量減少,擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門相對含量增加,放線菌門幾近消失;與模型組相比,GLH-H組和GLH-L組大鼠腸道中厚壁菌門相對含量增加,變形菌門相對含量減少。其中,模型組厚壁菌門/擬桿菌門的相對豐度比值(3.33)顯著低于對照組(11.07)(P<0.05),而GLH-H組和GLH-L組厚壁菌門/擬桿菌門的相對豐度比值(4.75)顯著高于模型組(P<0.05)。綜上表明,在給予GLH治療后,酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群紊亂現(xiàn)象得到改善。
圖3 GLH對酒精性脂肪肝大鼠門水平腸道微生物組成的影響Fig.3 Effect of GLH on the composition of intestinal floral on phylum level in rats with alcoholic fatty liver
本試驗通過飼喂SD大鼠Lieber-DeCarli 酒精液體飼料5周,建立酒精性脂肪肝模型研究鵝肝酶解物對酒精性脂肪肝的干預和作用機理,HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠肝小葉出現(xiàn)大量脂肪空泡,肝細胞普遍明顯腫大,具有嚴重脂肪變性現(xiàn)象,表明肝內(nèi)出現(xiàn)了脂肪沉積,這與Ajmo等[17]和Bai等[18]的研究結(jié)果相同,說明本次酒精性脂肪肝模型建立成功。本研究結(jié)果表明,與對照組比較,模型組大鼠的肝細胞脂肪變性明顯;與模型組相比,GLH-H組和GLH-L組大鼠的肝細胞脂肪變性明顯減輕。
本試驗中,食用相同體積的液體飼料,模型組大鼠體重顯著低于對照組,這是由于酒精使模型組大鼠對食物的利用率下降[19],而GLH-H組和GLH-L組逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象,且GLH-H組大鼠的體重更接近對照組大鼠體重,說明GLH可提高酒精性脂肪肝大鼠對食物的利用率。此外,模型組大鼠的肝臟指數(shù)顯著增大,這是酒精性脂肪肝的特點之一[20],而GLH-H組顯著降低了酒精性脂肪肝大鼠的肝臟指數(shù)。
甘油三酯是體內(nèi)能量的重要來源,也是人體內(nèi)含量最多的脂類,其合成的主要場所在肝臟[21]。慢性酒精攝入通過控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PGC-1a 和 SREBP-1c來抑制脂肪酸氧化,促進脂質(zhì)生成,進而導致肝臟中甘油三酯的積累[22]。本試驗結(jié)果表明,與對照組相比,模型組大鼠血清中尿素氮、甘油三酯、總膽固醇含量均顯著增加,其中大鼠血清甘油三酯含量約為對照組大鼠的3倍,模型組大鼠血清中總膽固醇含量較對照組有顯著性升高,這與前人研究結(jié)果相似[23-25]。此外,經(jīng)GLH治療后,大鼠血清中總膽固醇和甘油三酯含量均顯著降低,GLH-H組大鼠總膽固醇和甘油三酯含量接近對照組,說明GLH具有抑制TC生成、促進TG氧化分解的作用,進而影響脂質(zhì)分布、運轉(zhuǎn)與清除。
脂肪細胞因子,如傳統(tǒng)炎癥及免疫因子的啟動和致敏是酒精性脂肪肝形成的關(guān)鍵步驟[26]。慢性酒精攝入刺激激活庫否細胞(Kupffer cells,KC),產(chǎn)生大量TNF-α、IL-1和MCP-1等炎癥因子[27]。炎癥通路激活在乙醇導致的肝臟損傷中也發(fā)揮重要的作用,其中炎癥因子TNF-α 可以導致肝細胞壞死。本研究中,與對照組相比,模型組大鼠在酒精的刺激下,炎癥因子大量增加,其中TNF-α、IL-1和MCP-1含量分別約為對照組大鼠的1.78倍、1.55倍、1.63倍,但經(jīng)GLH治療后,大鼠血清中炎癥因子的水平均顯著下降,其中GLH-H組血清中的TNF-α含量與對照組無顯著差異。
腸道微生物是人體內(nèi)最重要的微生物群落,其本身及其代謝產(chǎn)物共同參與機體的物質(zhì)能量代謝及免疫調(diào)節(jié)[28],在能量的攝取、轉(zhuǎn)化、儲存的過程中起到了非常重要的作用。研究表明,腸道菌群結(jié)構(gòu)與某些代謝綜合征和心血管疾病相關(guān)[29-30],但腸道微生物和酒精性脂肪肝的互作關(guān)系的具體機制尚不清楚。有學者認為酒精的攝入會引起腸道微生物紊亂和過度增殖[31],酒精破壞了腸道屏障的完整性,對細菌源產(chǎn)物的滲透性增加,而這些產(chǎn)物加劇了酒精性脂肪肝的形成;也有學者認為細菌的過度增殖增加了乙醇代謝產(chǎn)物(乙醛)的濃度,而高濃度的乙醛促進脂肪合成酶活性的升高及脂肪合成量的增加,加劇肝內(nèi)脂肪酸和甘油三酯的沉積[28]。研究表明,通過“腸-肝”軸,腸道菌群紊亂及其代謝物對肝病具有重要的調(diào)節(jié)作用[32]。飲酒者結(jié)腸中變形菌門的增加會升高乙醛的濃度,這會影響細胞間的緊密結(jié)合和增加腸道的通透性[33]。本研究結(jié)果表明,酒精抑制了腸道中厚壁菌門的生長,促進了擬桿菌門、變形菌門的生長。而大鼠飼喂GLH后,使得其腸道中厚壁菌門與擬桿菌們的比例重新得到了回升,說明GLH對酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群失調(diào)具有一定的改善作用。
酒精性脂肪肝具有可治療性,這種程度的肝損傷具有可逆性。本試驗結(jié)果表明,GLH具有調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝大鼠肝功能指標,可以減輕酒精性脂肪肝大鼠肝小葉中的脂滴堆積的現(xiàn)象,預防因酒精刺激所產(chǎn)生的肝腫大,同時GLH可以改善酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群紊亂的現(xiàn)象,說明GLH具有明顯的預防酒精性脂肪肝發(fā)生的作用。接下來可進一步研究其有效成分,以便為開發(fā)治療酒精性脂肪肝藥物提供理論基礎(chǔ)。