拓昊苑 路風(fēng)中 張?jiān)?于好強(qiáng) 付鳳玲 李晚忱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，四川 成都 611130)

在遺傳轉(zhuǎn)化、誘變以及蛋白融合等操作中，通常需要通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段分離純化和連接等多個(gè)步驟構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體[1-4]。這種依賴于連接克隆(ligation-dependent cloning, LDC)的載體構(gòu)建方法，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且其依賴載體上適合的多克隆酶切位點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)建的載體在目的序列的前后插入了附加的限制性酶切位點(diǎn)序列，插入位點(diǎn)的靈活性不高[5-8]。近年來(lái)，隨著Gateway[9]、In-Fusion[10]、不依賴于序列和連接反應(yīng)克隆(sequence and ligation-independent cloning, SLIC)[11]、互補(bǔ)單鏈懸掛(complementary single stranded overhang, CSSO)[12-15]等不依賴于連接反應(yīng)克隆(ligation-independent cloning, LIC)技術(shù)的出現(xiàn)，能一定程度上彌補(bǔ)LDC技術(shù)的不足。但LIC技術(shù)需依賴于位點(diǎn)特異重組、同源重組、互補(bǔ)單鏈等附加序列，且操作步驟仍較為繁瑣[5-8]。研究者們對(duì)該技術(shù)進(jìn)行深入的改進(jìn)，并發(fā)明了通過(guò)質(zhì)粒全序列擴(kuò)增插入目的序列的LIC克隆和誘變技術(shù)[16-19]。

Unger等[20]在前人研究基礎(chǔ)上，發(fā)明了不依賴于限制性酶的克隆(restriction-free cloning, RF)技術(shù)。用1對(duì)3′-端與目的DNA序列同源，5′-端與目標(biāo)載體插入位點(diǎn)側(cè)翼序列同源的接頭引物，先從供體質(zhì)粒擴(kuò)增目的DNA序列，再分離純化產(chǎn)物作引物，退火至目標(biāo)載體的插入位點(diǎn)，完成一個(gè)線性擴(kuò)增，并將目的DNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物插入目標(biāo)載體，保留1個(gè)雙鏈切刻。然后用DpnⅠ酶消化去除甲基化的親代模板鏈后，用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并以內(nèi)源酶系修復(fù)雙鏈切刻。在此基礎(chǔ)上，Erijman等[21-22]發(fā)明了轉(zhuǎn)移PCR(transfer-PCR, T-PCR)技術(shù)，即設(shè)計(jì)1對(duì)3′-端與目的DNA序列退火溫度低于5′-端與目標(biāo)載體插入位點(diǎn)側(cè)翼序列退火溫度的接頭引物，將上述2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放入同一離心管內(nèi)，經(jīng)過(guò)連續(xù)兩輪退火溫度不同的PCR擴(kuò)增，從供體質(zhì)粒擴(kuò)增目的DNA序列，并整合到目標(biāo)載體的特異位點(diǎn)，保留1個(gè)雙鏈切刻。同樣，經(jīng)DpnⅠ酶消化去除甲基化的親代模板鏈后，用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并依靠?jī)?nèi)源酶系修復(fù)雙鏈切刻。研究表明，T-PCR技術(shù)可在不依賴連接、重組等條件下，將任意DNA片段插入環(huán)形質(zhì)粒的任意位點(diǎn)，無(wú)需限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段分離純化和連接等繁瑣的操作，且不必附加多余序列，所需的引物濃度也較常規(guī)的PCR更低[23]。此外，還可對(duì)目的DNA序列的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)、定向誘變，按分子設(shè)計(jì)創(chuàng)造突變體，已成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要工具[24]。

為研究玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(sucrose non-fermenting protein kinase 2, SnRK2)家族成員與其底物蛋白的互作在脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[25]，在前期酵母雙雜交篩選的基礎(chǔ)上[26]，需要構(gòu)建ZmSnRK2基因家族中8個(gè)成員的原生質(zhì)體表達(dá)載體[27]。由于目標(biāo)載體pHBT95缺少適合的酶切位點(diǎn)，選用T-PCR技術(shù)，從測(cè)序載體pMD19-T擴(kuò)增ZmSnRK2基因家族這8個(gè)成員的編碼序列，直接整合到目標(biāo)載體pHBT95啟動(dòng)子pRD29B下游。在同一離心管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行兩輪退火溫度不同的PCR擴(kuò)增，且第一輪擴(kuò)增采用退火溫度不同的兩段序列組成的接頭引物，第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增的中間產(chǎn)物為引物，將帶有目的DNA序列連接至目標(biāo)載體的插入位點(diǎn)。為避免錯(cuò)誤連接或未連接中間產(chǎn)物濃度過(guò)高對(duì)后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)的干擾，接頭引物兩段序列及其退火溫度的設(shè)計(jì)、引物及兩種質(zhì)粒模板的濃度，特別是溫度循環(huán)程序，都較普通PCR要求更高，需要更精細(xì)的設(shè)計(jì)與篩選(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)移PCR過(guò)程與原理Fig.1 Process and mechanism of transfer-PCR

1 材料與方法

1.1 ZmSnRK2基因家族成員的同源克隆

由MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.maizegdb.org/)檢索ZmSnRK2基因家族8個(gè)成員的編碼序列，利用Premier 5軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(表1)。取玉米模式自交系B73三葉期幼苗，用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，大連)提取總RNA，加入gDNA Eraser(TaKaRa，大連)去除可能的基因組DNA污染，然后用PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并以此為模板，用高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(TaKaRa，大連)PCR擴(kuò)增ZmSnRK2基因家族8個(gè)成員的編碼序列。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收，3′-端加多聚A后亞克隆至pMD19-T質(zhì)粒，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2 轉(zhuǎn)移PCR擴(kuò)增

利用Premier 5軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設(shè)計(jì)8對(duì)3′-端分別與ZmSnRK2基因家族8個(gè)成員的編碼序列同源，而5′-端與原生質(zhì)體表達(dá)載體pHBT95插入位點(diǎn)側(cè)翼序列同源的接頭引物，在Power BasicsTM型PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))上用New England Biolabs公司(北京)的Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase酶進(jìn)行T-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為5×GC buffer 10.0 μL、20 ng·L-1原生質(zhì)體表達(dá)載體pHBT95(目標(biāo)載體)和目的基因克隆載體pMD19-T(供體質(zhì)粒)各0.5 μL、1 mmol·μL-1上下游引物各1.0 μL、2.5 μmol·mL-1dNTP 4.0 μL、2.0 U·μL-1Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase 0.8 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)足至50 μL。采用以下3種溫度循環(huán)程序，篩選不同的引物序列與退火溫度組合：溫度循環(huán)程序1：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，各引物3′-端退火溫度退火1 min，72℃延伸90 s，循環(huán)13次。然后95℃延伸30 s，各引物5′-端退火溫度退火1 min，72℃延伸4 min，循環(huán)20次；72℃延伸6 min，4℃保持。

表1 ZmSnRK2基因編碼序列擴(kuò)增PCR引物Table 1 PCR primers for amplification of encoding sequences of the ZmSnRK2 genes

注：下劃線堿基CATATG和GAATTC分別為酵母雙雜交表達(dá)載體構(gòu)建所需的NdeⅠ和EcoR Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)，兩端各加2個(gè)保護(hù)堿基。

Note: The underlined basesCATATGandGAATTCwere the recognition sites ofNdeⅠ andEcoR Ⅰ used in construction of expression vectors for yeast two-hybrid,respectively. Two protective bases were added to each end.

溫度循環(huán)程序2：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，各引物3′-端退火溫度退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)25次。然后95℃變性30 s，各引物5′-端退火溫度退火30 s，72℃延伸4 min，循環(huán)20次；72℃延伸6 min，4℃保持。

溫度循環(huán)程序3：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，各引物3′-端退火溫度退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)25次。然后95℃變性30 s，各引物5′-端退火溫度退火1 min，72℃延伸4 min，循環(huán)20次；72℃延伸6 min，4℃保持。

擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，并在Imager? ChemiDocTMXRS型凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))成像，對(duì)引物序列及其退火溫度進(jìn)行初步篩選。

1.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和菌液PCR驗(yàn)證

在50 μL T-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入20 U·μL-1限制性內(nèi)切酶DpnⅠ 5 μL，37℃溫浴1 h，酶切去除未整合目的序列的pHBT95質(zhì)粒。用酶切產(chǎn)物熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa，大連)，涂布于含氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)的抗性LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，拍照記錄并用Clono-counter軟件計(jì)數(shù)菌落數(shù)[28]。各挑取10個(gè)單克隆接種至含Amp的抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)6 h，然后取1 μL培養(yǎng)液，依次加入10 pmol·L-1原生質(zhì)體表達(dá)載體pHBT95插入位點(diǎn)側(cè)翼序列(即原生質(zhì)體表達(dá)載體pHBT95-ZmSnRK2構(gòu)建T-PCR引物的5′端，表2中下劃線序列：5′-C G G C T C C C T C T C C C C T T G C T C C G T G G A T CC-3′/5′-G T A G T C T G G A A C G T C G T A T G G G T AA G G C CT-3′)引物各0.4 μL、dNTP 1.6 μL、rTaq酶(TaKaRa，大連)0.2 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足至20 μL，再于Power BasicsTM型PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。溫度循環(huán)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，Imager? ChemiDocTMXRS型凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))成像，確認(rèn)目的序列整合到原生質(zhì)體表達(dá)載體pHBT95后，用TIANGEN公司(北京)質(zhì)粒小提試劑盒DP103提取質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司并用上述表達(dá)載體pHBT95插入位點(diǎn)側(cè)翼序列引物雙向測(cè)序，利用DNAMAN V6軟件(http://www.lynnon.com/)分析對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-PCR引物序列及其退火溫度

由表2可知，因?yàn)閮蓷l接頭引物3′-端的理論退火溫度不同，按上述3種溫度循環(huán)程序篩選后，第一輪擴(kuò)增的退火溫度因接頭引物3′-端序列不同而存在差異。在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差不大的情況下，篩選的退火溫度低于或接近其中較低的理論退火溫度；在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差較大的情況下，篩選的退火溫度高于其中較低的理論退火溫度，如基因ZmSnRK2.10，第一輪擴(kuò)增篩選退火溫度為60.0℃，高于其中較低的理論退火溫度(49.0℃)。因?yàn)?對(duì)引物5′-端序列相同，所以第二輪擴(kuò)增退火溫度的篩選值相同，均低于兩條引物理論退火溫度的平均值。

表2 pHBT95-ZmSnRK2構(gòu)建的T-PCR引物序列及退火溫度Table 2 Primer sequences and annealing temperatures of T-PCR for pHBT95-ZmSnRK2 construction

注：下劃線堿基為pHBT95質(zhì)粒插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。

Note: The underlined bases are the flanking sequence of the insertion site of plasmid pHBT95.

2.2 溫度循環(huán)程序的優(yōu)化

用篩選的退火溫度和3種不同的溫度循環(huán)程序進(jìn)行T-PCR擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶DpnⅠ消化去除未整合目的序列的pHBT95質(zhì)粒后，熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp的抗性LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12 h，用溫度循環(huán)程序3擴(kuò)增構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性單克隆最多(圖2-A)。統(tǒng)計(jì)ZmSnRK2基因家族8個(gè)成員編碼序列的擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2-B)，3種溫度循環(huán)程序間的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。在第一輪溫度循環(huán)中，與目的序列同源的接頭引物3′-端序列較短，以30 s為宜；相反，為增加中間PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，第一輪循環(huán)數(shù)以25次為宜。在第二輪溫度循環(huán)中，由于中間PCR產(chǎn)物較長(zhǎng)，與目標(biāo)載體插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的退火時(shí)間不能太短，應(yīng)保持1 min左右[21-22]。綜上，以溫度循環(huán)程序3更為適宜，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化獲得的陽(yáng)性克隆數(shù)極顯著高于其他兩種溫度循環(huán)程序。

注：**表示在0.01水平上差異顯著。Note: ** indicates significance difference at 0.01 level.圖2 不同溫度循環(huán)程序T-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌陽(yáng)性克隆數(shù)Fig.2 Number of positive clones of Escherichia coli transformed by T-PCR amplified products under different temperature cycles

2.3 陽(yáng)性克隆的菌液PCR及測(cè)序驗(yàn)證

上述陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，大多數(shù)均呈現(xiàn)陽(yáng)性，8個(gè)重組的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化率(ZmSnRK2.10)均在50%以上(圖3)，表明采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行T-PCR擴(kuò)增，構(gòu)建表達(dá)載體的成功率較高。由圖4可知，構(gòu)建到原生質(zhì)體表達(dá)載體pHBT95中的基因編碼序列與構(gòu)建前克隆測(cè)序的結(jié)果完全匹配。菌液PCR產(chǎn)物檢測(cè)為陽(yáng)性的培養(yǎng)液提取質(zhì)粒，雙向測(cè)序結(jié)果正確，說(shuō)明通過(guò)T-PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建載體是可行的。

注：M：DNA分子標(biāo)記；P：陽(yáng)性對(duì)照；1～10：擴(kuò)大培養(yǎng)菌液。Note: M: DNA molecular marker. P: Positive control. 1-10: Bacterial culture.圖3 陽(yáng)性克隆菌液PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of bacterial PCR product of positive clones

圖4 pHBT95-ZmSnRK2.11與ZmSnRK2.11的序列比對(duì)Fig.4 Sequence alignment between pHBT95-ZmSnRK2.11 and ZmSnRK2.11

3 討論

用T-PCR技術(shù)構(gòu)建目標(biāo)載體，需要在同一離心管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行兩輪退火溫度不同的PCR擴(kuò)增，接頭引物的3′-端需根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)，所以退火溫度存在差異。按照Erijman等[21-22]的方法，用一種退火溫度很難完成不同的目的序列的載體構(gòu)建。本研究在ZmSnRK2基因家族8個(gè)成員的原生質(zhì)體表達(dá)載體構(gòu)建中，通過(guò)反復(fù)的序列選比設(shè)計(jì)引物，盡可能使一對(duì)引物兩條序列同一端(3′-端或5′-端)的理論退火溫度相近，并確保第一輪擴(kuò)增退火溫度低于第二輪擴(kuò)增的退火溫度，然后對(duì)擴(kuò)增篩選實(shí)際可行的退火溫度進(jìn)行探究。ZmSnRK2.10基因的編碼序列很難滿足上述要求，所以最終設(shè)計(jì)的兩條引物第一輪擴(kuò)增的理論退火溫度差異較大，這可能也是菌液PCR檢測(cè)結(jié)果中用pHBT95-ZmSnRK2.10轉(zhuǎn)化的菌株陽(yáng)性率低于其他基因構(gòu)建載體的原因，但其最低的轉(zhuǎn)化率仍達(dá)50%以上，高于Erijman等[21-22]的結(jié)果。

T-PCR對(duì)擴(kuò)增效率要求不高，但不允許堿基錯(cuò)配，所以建議采用高保真DNA聚合酶。Erijman等[21-22]認(rèn)為T(mén)-PCR反應(yīng)體系的所有成分加入同一離心管，反應(yīng)的總體積應(yīng)減小至10 μL以下, 但其材料方法又介紹是50 μL反應(yīng)體系。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)比較，本研究采用普通PCR的50 μL反應(yīng)體系，且并未發(fā)現(xiàn)有何不利影響。引物和載體質(zhì)粒的濃度都是T-PCR成敗的關(guān)鍵，其對(duì)防止第一輪擴(kuò)增中間產(chǎn)物濃度過(guò)高，保證第二輪的線性擴(kuò)增，并整合到目的載體特異位點(diǎn)十分重要[21-22]。本研究選用的引物濃度僅為20 nmol·L-1，遠(yuǎn)低于普通PCR常用的200～1 000 nmol·L-1，但擴(kuò)增構(gòu)建載體的轉(zhuǎn)化率達(dá)60%以上，完全可以滿足試驗(yàn)要求。下一步可對(duì)引物和載體質(zhì)粒的濃度作進(jìn)一步篩選優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)化率。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用T-PCR技術(shù)可簡(jiǎn)化表達(dá)載體構(gòu)建操作，且不依賴于載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，也無(wú)需購(gòu)買(mǎi)載體構(gòu)建試劑盒，但要在同一離心管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行兩輪退火溫度不同的PCR擴(kuò)增，需根據(jù)不同的目的序列逐一進(jìn)行接頭引物設(shè)計(jì)和退火溫度等條件篩選。本研究通過(guò)優(yōu)化的溫度循環(huán)程序?yàn)楸磉_(dá)或誘變載體構(gòu)建提供了一定的理論參考。