湯夏安，劉彩蓮，鄧業(yè)成，馮蓓蓓，駱海玉，鄧志勇

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006)

橘霉素是由青霉屬、曲霉屬、紅曲霉屬等真菌產(chǎn)生的一種聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物，常引起糧食和食品污染，但同時(shí)也具有廣譜的生物活性，包括抗細(xì)菌和真菌活性，以及潛在的抗癌活性和神經(jīng)保護(hù)作用[1-2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-9可產(chǎn)生橘霉素，并且顯示出廣譜的抗植物病原真菌活性，在農(nóng)用殺菌劑領(lǐng)域具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值。因?yàn)樵谕ǔl件下內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)生橘霉素的量較低，所以通過優(yōu)化內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的發(fā)酵條件以提高橘霉素的產(chǎn)量，對(duì)橘霉素的開發(fā)利用具有重要意義。

響應(yīng)面法是一種利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析優(yōu)化工藝參數(shù)，預(yù)測(cè)響應(yīng)值的統(tǒng)計(jì)方法[3]。響應(yīng)面法具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度高等優(yōu)點(diǎn)，已在食品、醫(yī)藥、生物工程、發(fā)酵工程等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4-13]。為此，利用響應(yīng)面法探索內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的最佳發(fā)酵條件，以期提高橘霉素的產(chǎn)量，旨在為今后利用內(nèi)生真菌DBR-9大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)橘霉素奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 內(nèi)生真菌DBR-9從采自廣西植物研究所種質(zhì)園的廣西地不容塊根中分離獲得。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 mL。上述培養(yǎng)基均為自然pH值，且在121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.1.3 試劑及儀器 磷酸、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、瓊脂粉、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鉀、酵母粉等均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；橘霉素純品由本實(shí)驗(yàn)室分離制得；色譜純甲醇購(gòu)自美國(guó)天地有限公司；超純水由美國(guó)Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)制得。安捷倫1260 Infinity液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司；色譜柱Sapphire-C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)購(gòu)自美國(guó)賽默飛科技公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)H2050R購(gòu)自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LYZ-2102C恒溫?fù)u床購(gòu)自上海龍躍儀器設(shè)備公司。

1.2 方法

1.2.1 橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液配制 準(zhǔn)確稱取10 mg橘霉素純品，用適量色譜純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用色譜純甲醇定容至刻度，配制成100 mg/L的橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液備用。

1.2.2 橘霉素含量分析 發(fā)酵液在12 000 r/min、5 ℃條件下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，用色譜純甲醇稀釋發(fā)酵液(V甲醇∶V發(fā)酵液=9∶1)，然后采用HPLC進(jìn)行分析。參照陳蘊(yùn)等[14]的方法設(shè)定HPLC分析條件：采用C18柱(Sapphire-C18，4.6 mm×150 mm×5 μm)，柱溫28 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水(體積比55∶45)，用磷酸調(diào)pH值為4.0；流速為1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.3 發(fā)酵方法 在種子培養(yǎng)基上接種0.1 mL孢子液并涂布均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。用20 mL無菌水將培養(yǎng)基表面的孢子洗下，并用擦鏡紙過濾，制成孢子懸浮液(種子液)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后備用。取250 mL三角瓶加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，滅菌后接入孢子懸浮液，置于搖床中26 ℃、160 r/min培養(yǎng)。不同條件處理重復(fù)3 次。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別選擇葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖作為碳源(設(shè)置10、20、30、40、50、60 g/L的質(zhì)量濃度梯度)，選擇硝酸鈉、蛋白胨和酵母粉作為氮源(設(shè)置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的質(zhì)量濃度梯度)，選擇硫酸亞鐵、氯化鉀、氯化鈉和硫酸鎂作為無機(jī)鹽(設(shè)置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的質(zhì)量濃度梯度)，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30、35、40 d，初始接種量分別設(shè)置為1、2、3、4、5、6個(gè)單位(每個(gè)單位為5.2×106個(gè)孢子)。

1.2.5 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用PB試驗(yàn)確定影響內(nèi)生菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的主要因素。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素高低水平，每個(gè)因素2個(gè)水平(表1)。其中，因素C、F、J為虛擬因素，用于平衡誤差。

1.2.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在響應(yīng)面試驗(yàn)中，為了得到有效的響應(yīng)面擬合方程，所選各個(gè)因素的水平必須逼近最優(yōu)因素水平的區(qū)域，因此必須進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。在PB試驗(yàn)中得到影響顯著的關(guān)鍵因素基礎(chǔ)上，根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果所擬合的一階擬合方程中的變量系數(shù)設(shè)定關(guān)鍵影響因素的爬坡方向和步長(zhǎng)，若變量系數(shù)為正，則變量水平需在梯度遞增的方向進(jìn)行爬坡，反之亦然。這樣可快速經(jīng)濟(jì)地逼近最大響應(yīng)值區(qū)域。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman test design

1.2.7 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以PB試驗(yàn)所確定的影響顯著因素作為試驗(yàn)因素，并以最陡爬坡試驗(yàn)中得到的橘霉素產(chǎn)量最大時(shí)的因素水平作為中心點(diǎn)，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)產(chǎn)橘霉素的培養(yǎng)條件進(jìn)行三因素五水平響應(yīng)面試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.2 Factors and levels of response surface center combination test design g/L

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0處理，PB試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Design-Expert 10.0.4軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

將橘霉素儲(chǔ)備液用色譜純甲醇稀釋配成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、12.5、25、50、100 mg/L的樣品溶液，在設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行 HPLC 分析。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，橘霉素質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=16.614x-27.282，r2=0.999 4。說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度高，線性關(guān)系好。

2.2 發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同碳源種類及其含量對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響見圖1a。橘霉素質(zhì)量濃度隨著碳源質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。與其他2種碳源相比，葡萄糖效果較好。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，DBR-9發(fā)酵產(chǎn)物中橘霉素質(zhì)量濃度最大，達(dá)到578.88 mg/L，故選取葡萄糖為條件優(yōu)化的碳源。

不同氮源種類及其含量對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響見圖1b。與其他2種氮源相比，酵母粉效果較好。當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，DBR-9發(fā)酵產(chǎn)物中橘霉素質(zhì)量濃度最大，達(dá)到528.03 mg/L，故選取酵母粉為條件優(yōu)化的氮源。

無機(jī)鹽對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響見圖1c。隨著無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的增加，橘霉素質(zhì)量濃度先增大后減小。氯化鉀質(zhì)量濃度為0.3 g/L時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值449.67 mg/L。氯化鈉質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值455.65 mg/L。硫酸亞鐵質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值430.45 mg/L。硫酸鎂質(zhì)量濃度為0.3 g/L時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值449.02 mg/L。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響見圖1d。在5～30 d的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，橘霉素質(zhì)量濃度隨發(fā)酵天數(shù)的增加而增加，之后隨發(fā)酵天數(shù)的增加橘霉素質(zhì)量濃度下降。在30 d時(shí)橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值465.07 mg/L。

初始接種量對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響見圖1e。當(dāng)孢子初始接種量為3個(gè)單位(5.2×106×3個(gè)孢子)時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值513.54 mg/L，之后隨初始接種量增加橘霉素質(zhì)量濃度下降。

2.3 發(fā)酵PB試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)采用n=12(至多可以分析11個(gè)因素)的設(shè)計(jì)方法，分析了葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間、初始接種量、氯化鉀質(zhì)量濃度、氯化鈉質(zhì)量濃度、硫酸亞鐵質(zhì)量濃度、硫酸鎂質(zhì)量濃度等8個(gè)真實(shí)因素和3個(gè)虛擬因素共11個(gè)因素對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表3。利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度、氯化鈉質(zhì)量濃度對(duì)內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素的影響顯著(P<0.05)，因素效應(yīng)大小依次為葡萄糖>酵母粉>氯化鈉，所以選擇這3個(gè)因素進(jìn)入下一步優(yōu)化試驗(yàn)。其他非顯著因素的取值根據(jù)各因素的效應(yīng)正負(fù)以及大小而定，正效應(yīng)取高水平，負(fù)效應(yīng)取低水平，即初始接種量為4個(gè)單位(5.2×106×4個(gè)孢子)、發(fā)酵時(shí)間為35 d，此外，因?yàn)榱硗?種無機(jī)鹽氯化鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂對(duì)DBR-9產(chǎn)橘霉素影響不顯著且遠(yuǎn)低于上述3個(gè)主要因素，為了節(jié)省成本、減少操作步驟，在接下來的試驗(yàn)中對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基不再添加這3種無機(jī)鹽。

a.碳源的影響；b.氮源的影響；c.無機(jī)鹽的影響；d.發(fā)酵時(shí)間的影響；e.初始接種量的影響

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Plackett-Burman test design and results

續(xù)表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3(Continued) Plackett-Burman test design and results

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.4 Variance analysis of Plackett-Burman test results

注：*表示影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

Note: * indicates that the effect reaches a significant level(P<0.05).

2.4 發(fā)酵最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖、酵母粉為正效應(yīng)進(jìn)行正爬坡，氯化鈉為負(fù)效應(yīng)進(jìn)行負(fù)爬坡。根據(jù)3個(gè)因素的效應(yīng)大小比例設(shè)定它們的變化方向以及步長(zhǎng)，具體試驗(yàn)方案以及結(jié)果見表5。由表5可知，第3組試驗(yàn)方案即葡萄糖35 g/L、酵母粉1.25 g/L、氯化鈉0.35 g/L時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度最大，此時(shí)以各因素質(zhì)量濃度為坐標(biāo)值所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)逼近最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域。所以以第3組試驗(yàn)方案各因素的質(zhì)量濃度值作為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)分析。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.5 The steepest climbing test design and results

2.5 發(fā)酵響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果

由表6響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析獲得二次擬合回歸方程：橘霉素質(zhì)量濃度Y=642.49+35.94A+93.55B+34.84C+20.14AB+9.38AC+7.14BC-48.70A2-59.65B2-61.49C2。對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。由表7可知，模型P<0.000 1，表明該模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)P=0.145 2>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型高度符合，因此模型選擇正確。該模型R2為0.986 2，AdjR2為0.973 8，兩者數(shù)值較接近，說明該模型用于實(shí)際預(yù)測(cè)時(shí)誤差小，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。模型Adeq Precisior信噪比為25.744，可信度高。在回歸模型中，A、B、C、A2、B2、C26項(xiàng)的P<0.000 1，表現(xiàn)為極顯著，AB項(xiàng)中0.01≤P<0.05，表現(xiàn)為顯著，說明上述各項(xiàng)對(duì)發(fā)酵液中橘霉素產(chǎn)量均有顯著影響。

表6 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.6 Response surface center combination test design and results

表7 響應(yīng)面模型方差分析Tab.7 Variance analysis of response surface model

注：R2=0.986 2；AdjR2=0.973 8；Adeq Precisior=25.744；*表示差異達(dá)到顯著水平(0.01≤P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:R2=0.986 2; AdjR2=0.973 8; Adeq Precisior=25.744;* indicates that the difference reaches a significant level (0.01≤P<0.05)，and ** indicates that the difference is extremely significant (P<0.01).

利用Design-Expert 10.0.4軟件分別繪制出AB、AC和BC交互項(xiàng)的等高線圖和響應(yīng)曲面圖(圖2、圖3和圖4)。因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度由響應(yīng)曲面的陡峭程度反映，曲面越陡峭，說明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大，反之，則對(duì)響應(yīng)值的影響越小。從響應(yīng)曲面圖(圖2b、3b、4b)可以看出，當(dāng)其中1個(gè)因素的值固定在中心水平時(shí)，橘霉素質(zhì)量濃度隨另外2個(gè)因素的變化先增加后逐步下降，這說明3個(gè)因素之間存在明顯的交互作用。

2.6 最佳發(fā)酵條件的確定與驗(yàn)證

利用Design-Expert 10.0.4軟件對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得最佳發(fā)酵條件為葡萄糖38.628 g/L、酵母粉1.474 g/L、氯化鈉0.379 g/L，此時(shí)橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值699.327 mg/L。在最適因素水平條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌DBR-9產(chǎn)橘霉素質(zhì)量濃度達(dá)到692.421 mg/L，與模型預(yù)測(cè)值無顯著差異，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

圖2 葡萄糖(A)與酵母粉(B)交互影響的等高線(a)與響應(yīng)曲面(b)Fig.2 Contour line(a)and response surface(b)of interaction between glucose (A) and yeast powder (B)

圖3 酵母粉(B)與氯化鈉(C)交互影響的等高線(a)與響應(yīng)曲面(b)Fig.3 Contour line(a) and response surface(b) of interaction between yeast powder (B) and sodium chloride (C)

圖4 葡萄糖(A)與氯化鈉(C)交互影響的等高線(a)與響應(yīng)曲面(b)Fig.4 Contour line(a)and response surface(b) of interaction between glucose (A) and sodium chloride (C)

3 結(jié)論與討論

通過采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，篩選出適合廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-9發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基成分組合，即酵母粉、葡萄糖、氯化鈉質(zhì)量濃度分別為1.474、38.628、0.379 g/L。在最佳培養(yǎng)基成分組合及初始接種量20.8×106個(gè)孢子、發(fā)酵時(shí)間35 d條件下發(fā)酵，橘霉素質(zhì)量濃度可達(dá)到692.421 mg/L，和預(yù)測(cè)值699.327 mg/L十分接近，與原始發(fā)酵液(初始接種量為10.4×106個(gè)孢子，采用未額外添加任何物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵30 d)的橘霉素質(zhì)量濃度581.817 mg/L相比提高了19.01%。研究結(jié)果為進(jìn)一步利用廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-9大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)抗菌物質(zhì)橘霉素奠定了基礎(chǔ)。

本研究?jī)H在室內(nèi)進(jìn)行小瓶發(fā)酵試驗(yàn)，并未對(duì)廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-9進(jìn)行放大培養(yǎng)以及大型發(fā)酵罐培養(yǎng)，有關(guān)DBR-9發(fā)酵產(chǎn)橘霉素的工業(yè)化生產(chǎn)條件還需要進(jìn)一步摸索。此外，沒有對(duì)橘霉素大規(guī)?？焖偬崛》椒ㄟM(jìn)行優(yōu)化，這也是下一步需要研究的方向。