王 芳，吳 鵬，張珍珠，劉林馨，段玉璽

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院/抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

泛素/26S蛋白酶體途徑(Ubiquintin/26S-proteasome system，UPS)是真核生物體內(nèi)高度保守的選擇性蛋白質(zhì)降解的主要途徑。這一過程中，在ATP供能條件下，泛素(Ub)與泛素激活酶(E1)結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移至泛素結(jié)合酶(E2)。E2中間體與泛素連接酶(E3)催化泛素轉(zhuǎn)移至特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)和/或自動泛素化 E3本身。E3在泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解過程中負(fù)責(zé)識別特異性的底物蛋白，被認(rèn)為是泛素化過程中最重要的組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中超過1 400個基因編碼E3泛素連接酶, 其中許多含有相同的RING-finger蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，稱之為 RING(Really interesting new gene)家族，在40～60個氨基酸殘基中具有一段保守的序列Cys-X2-Cys-X(9～39)-Cys-X(1～3)-His-X(2～3)-Cys/His-X2-Cys-X(4～48)-Cys-X2-Cys，是數(shù)量最龐大、類型最豐富的一類單亞基連接酶。經(jīng)預(yù)測，擬南芥中存在477個RING-finger E3連接酶，水稻中488個，蘋果中688個，蕪菁中715個，大豆中760個[1-6]。它們具有一類特殊的RING-finger結(jié)構(gòu)域，其由8個間隔精確的半胱氨酸和組氨酸殘基組成，以交叉支撐(Cross-brace)的形式協(xié)調(diào)2個鋅離子。根據(jù)第5位氨基酸是Cys還是His，分為RING-H2(C3H2C3)和RING-HC(C3HC4)2種，此外還有一些非典型的RING-finger結(jié)構(gòu)域，如RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T、RING-G等。RING-finger 與E2泛素結(jié)合酶結(jié)合，將E2和底物結(jié)合在一起。

在RING家族中有1個特殊亞族ATL(ArabidopsisTóxicos en Levadura)，該家族蛋白質(zhì)含有1個高度保守的RING-H2 zinc finger結(jié)構(gòu)域和至少1個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，在激發(fā)子處理后快速誘導(dǎo)表達。對ATL的功能分析表明，其調(diào)節(jié)植物中不同的途徑，包括幼苗萌發(fā)后生長過渡、根系發(fā)育過程中細(xì)胞死亡的調(diào)控、胚乳發(fā)育過程或短日條件下向開花過渡過程中的氮素響應(yīng)、激發(fā)子及抗病反應(yīng)等生物進程[7]。

大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematode，SCN，Heteroderaglycines)是一種內(nèi)寄生線蟲，在大豆生產(chǎn)中造成重大的經(jīng)濟損失。課題組在前期研究中，通過構(gòu)建大豆胞囊線蟲誘導(dǎo)小粒黑豆(Glycinemax)的早期基因差異表達SSH-cDNA文庫，篩選到1個差異表達基因EST片段，在NCBI中進行BLASTn比對，該片段與大豆序列XM_003521788同源，一致性為99%，推測該基因片段為RING家族成員，參與抗線蟲反應(yīng)。為進一步驗證和明確該基因的功能，利用RT-PCR方法克隆該基因cDNA序列，分析其在大豆胞囊線蟲侵染前期的表達量變化模式，為該基因的功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大豆類型為小粒黑豆(國家編號ZDD1412)，其抗大豆胞囊線蟲3號生理小種，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲所保存。大豆胞囊線蟲3號生理小種由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲實驗室繁殖保存。

1.2 線蟲接種

將大豆種子用1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水清洗，放入濕潤的無菌濾紙培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)催芽2 d。待胚根長到約1 cm時移至塑料缽(12 cm×13 cm，含50%細(xì)沙、50%有機土壤)中，每缽移植1株幼苗。

用組織研磨器將大豆胞囊線蟲卵從胞囊中釋放出來，置于0.545 g/L的ZnCl2溶液中，27 ℃刺激線蟲孵化3 d。大豆真葉展開后進行接種。在每棵植株根部附近注入4 000個二齡幼蟲/卵的懸浮液。接種后12、24、36、48、72 h 取大豆根尖組織，液氮速凍，-70 ℃保存。以接種無菌水為對照。每個處理10株，重復(fù)3次。

1.3 核酸的提取及cDNA合成

使用TRizol (天根)試劑提取大豆根尖組織總RNA，按照Promega Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反應(yīng)體系為20 μL，其中MgCl24 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，dNTP混合物2 μL，RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL，Oligo(dT)15引物1 μL，總RNA 1 μg，加無核酸酶水至總體積20 μL。42 ℃溫育60 min，95 ℃ 加熱5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 GmRHF1基因的克隆

根據(jù)NCBI中大豆參考序列XM_003521788，設(shè)計GmRHF1基因特異性擴增引物(表1)，進行PCR擴增。反應(yīng)體系：cDNA模板1.5 μL，2×TaqPCR Master Mix(天根)12.5 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃ 變性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，連接至pGEM-T Easy Vector(Promega，USA)，將含有目的基因的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司測序。

表1 克隆和qRT-PCR反應(yīng)的引物序列

1.5 不同處理GmRHF1基因表達分析

提取不同時間未接種及接種線蟲的大豆根尖組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，以大豆Actin11為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計實時熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)，利用qRT-PCR反應(yīng)，分析線蟲侵染前期根部GmRHF1的表達模式。反應(yīng)體系參照熒光定量試劑盒SYBR Green(天根，F(xiàn)P209)說明書。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進行基因相對表達量分析。

1.6 序列生物信息學(xué)分析

在NCBI進行BLAST同源比對、開放閱讀框分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)及外顯子數(shù)目和位置預(yù)測(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)；利用在線軟件分析氨基酸序列組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(pI)等理化性質(zhì)(http://web.expasy.org/protparam/)。采用DNAMAN 6.0 進行氨基酸序列比對，采用MEGA 5.0對大豆、擬南芥等RING-H2氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析和LSD顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小粒黑豆GmRHF1基因克隆

根據(jù)前期構(gòu)建的大豆胞囊線蟲誘導(dǎo)小粒黑豆表達SSH-cDNA文庫獲得的EST序列M0509，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn比對，利用 Primer Premier 5 設(shè)計特異性引物，以小粒黑豆cDNA為模板，PCR擴增獲得大小約為1 300 bp的片段(圖1)。采用凝膠純化回收該片段，克隆后經(jīng)藍(lán)白斑篩選，用EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶對重組子酶切，電泳鑒定結(jié)果表明，目的基因已成功克隆至載體中(圖2)。測序產(chǎn)物在GenBank中經(jīng)BLASTn比對分析，與大豆參考序列相似性達100%，將其命名為GmRHF1。

2.2 小粒黑豆GmRHF1 生物信息學(xué)分析

2.2.1 氨基酸序列分析 從小粒黑豆中克隆目標(biāo)基因GmRHF1的cDNA，其位于大豆基因組3號染色體上，在263—1 045 bp處有一個外顯子區(qū)，含有完整的編碼區(qū)序列(CDS)，長度783 bp，編碼260個氨基酸。經(jīng)ExPASy 軟件預(yù)測，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為27 880.43 u，分子式C1 211H1 907N343O383S15，pI為5.59。在NCBI數(shù)據(jù)庫中用CDD search進行基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)在N末端102—145位氨基酸處具有RING-H2 finger(C3H2C3型)結(jié)構(gòu)模體C-X2-C-X(9～39)-C-X(1～3)-H-X(2～3)-H-X2-C-X(4～48)-C-X2-C，結(jié)構(gòu)域氨基酸序列為CAVCLSEVVEGEKARLLPKCNHGFHVACIDMWFQ-SHSTCPLC。在模體上具有Zn2+結(jié)合和多肽底物結(jié)合2個功能位點。其屬于RING-finger H2_EL5 亞類、RING Ubox超家族(圖3)。

M.DL2000 Marker；1.cDNA擴增產(chǎn)物

M.DL2000 Marker；1.重組質(zhì)粒EcoR I酶切產(chǎn)物

圖3 GmRHF1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果Fig.3 Conserved domain of GmRHF1 protein predicted by CDD software

利用在線軟件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)及HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer)對GmRHF1蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果均顯示，GmRHF1的1—22位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，23—45位氨基酸(IMIVVIIIMFFVIVIALCLHLFA)之間有一個典型的跨膜螺旋區(qū)，46—260位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)(圖4)。

圖4 GmRHF1蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果Fig.4 Prediction of GmRHF1 transmembrane region

2.2.2 同源性比對分析 將 GmRHF1氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp比對，從擬南芥、大豆、水稻、辣椒及秀麗隱桿線蟲中檢索到與 GmRHF1同家族或具有相同功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，進行氨基酸序列比對(圖5)。這些序列具有相似的GLD 保守區(qū)域及RING-H2 zinc finger 模體。Gm-RHF1(XP_003521836.1)與栽培大豆(Glycinemax)ATL3家族的2個蛋白質(zhì)(XP_003548383.1、XP_003529860.1)在RING-H2 模體中分別存在5個和4個氨基酸差異，與苜蓿(Medicagotruncatula)ATL3蛋白(XP_013450635.1)存在7個氨基酸差異，與栽培大豆ATL63蛋白(XP_003552944.1)存在11個氨基酸差異，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)ATL3蛋白(AAD33581.1)存在6個氨基酸差異。系統(tǒng)進化樹分析表明，GmRHF1與苜蓿ATL3蛋白(XP_013450635.1)的親緣關(guān)系最近，其次是栽培大豆ATL3

蛋白(XP_003548383.1、XP_003529860.1)，再次是栽培大豆ATL63蛋白(XP_003552944.1)、野生大豆(Glycinesoja)ATL3蛋白(A0A0B2P3C5)等，與模式線蟲秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)Rbx1蛋白(BAB83695.1)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖6)。

2.2.3 與擬南芥 ATL家族成員進化關(guān)系分析 由于擬南芥是模式植物，其中RING-H2類型中的ATL家族成員的研究較深入，故將大豆GmRHF1與擬南芥 ATL家族成員進行進化關(guān)系分析(圖7)。從UniProtKB數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中檢索RING-H2 ATL 家族成員，共檢索到擬南芥成員84個、水稻成員2個，與GmRHF1(XP_003521836.1)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，GmRHF1與 擬南芥ATL3和ATL60相似度較高，親緣關(guān)系較近，與擬南芥ATL家族中鑒定到的第一個成員ATL2也在一個大的聚類中。

2.3 小粒黑豆根組織中GmRHF1基因誘導(dǎo)表達分析

利用qRT-PCR方法探索在接種大豆胞囊線蟲后12～72 h，小粒黑豆根尖組織GmRHF1基因表達量的變化。對試驗中涉及的主要參數(shù)進行分析，內(nèi)參基因和目的基因的擴增曲線均為標(biāo)準(zhǔn)的S型(圖8)。在第19個循環(huán)處進入指數(shù)增長期，熔解曲線的峰型單一(圖9)，表明樣品質(zhì)量較高，引物特異性較好，無引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物。

研究結(jié)果表明，GmRHF1在接種無菌水的對照組內(nèi)表達量相對穩(wěn)定；接種大豆胞囊線蟲后12～48 h，其表達量均呈現(xiàn)上升趨勢，分別為對照樣品中表達量的3.04、3.75、2.24、1.66倍，均達到顯著性差異(P<0.05)；接種后72 h，表達量是對照的0.85倍，比對照下降15%，未達到顯著性差異(P>0.05)(圖10)。由此表明，該基因參與線蟲侵染前期的抗病反應(yīng)。

Gm.Glycine max; Gs.Glycine soja; Mt.Medicago truncatula; At.Arabidopsis thaliana; Ca.Capsicum annuum;

圖6 GmRHF1(XP_003521836.1)與其他物種RING-H2 zinc finger蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of GmRHF1(XP_003521836.1)and other RING-H2 zinc finger proteins

圖7 GmRHF1與擬南芥ATL家族成員的進化關(guān)系分析Fig.7 Phylogenic analysis of GmRHF1 and ATL proteins from Arabidopsis thaliana

圖8 Actin11和GmRHF1的擴增曲線Fig.8 Amplification plots of Actin11 and GmRHF1

圖9 Actin11和 GmRHF1的熔解曲線Fig.9 Dissociation curve of Actin11 and GmRHF1

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著

3 結(jié)論與討論

可逆的蛋白質(zhì)泛素化作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，不需要從頭合成蛋白質(zhì)，可使細(xì)胞對外界刺激做出快速和特異性反應(yīng)。E3泛素連接酶在這一途徑中負(fù)責(zé)識別特異性底物蛋白，被認(rèn)為是泛素化過程中最重要的組成部分。其中，Ring-finger型蛋白家族是數(shù)量最龐大、類型最豐富的一類單亞基連接酶。ATL家族是一個含有RING-H2結(jié)構(gòu)域的特殊家族，含有1個高度保守的RING-H2 zinc finger結(jié)構(gòu)域和至少1個跨膜結(jié)構(gòu)域，在激發(fā)子處理后快速誘導(dǎo)表達，在擬南芥中有91個成員，在水稻中有121個成員[7]。本研究中，大豆GmRHF1含有1個RING-H2結(jié)構(gòu)域和1個跨膜區(qū)，同源比對及系統(tǒng)進化分析表明，其屬于 RING-H2 zinc finger ATL3 類，與擬南芥ATL家族具有一定的進化關(guān)系。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物RING-H2 ATL類中的基因參與抗病防御反應(yīng)。擬南芥ATL2基因由幾丁質(zhì)特異性誘導(dǎo)，在激發(fā)子反應(yīng)通路早期以及水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的防御反應(yīng)通路中發(fā)揮作用[8]。ATL6和ATL31參與對番茄細(xì)菌性疫病病原菌(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000)的防御反應(yīng)[9]。ATL9是ATL家族中含有PEST結(jié)構(gòu)域的一種特殊蛋白質(zhì)，參與對活體營養(yǎng)型生物病原真菌續(xù)斷菊白粉病菌(Golovinomycescichoracearum)的基礎(chǔ)抗性，以及幾丁質(zhì)和NADPH氧化酶介導(dǎo)的防御反應(yīng)[10]。

在NCBI數(shù)據(jù)庫保守結(jié)構(gòu)域Conserved Domains中分析發(fā)現(xiàn)，GmRHF1具有類RING-H2_EL5結(jié)構(gòu)特征。EL5又稱蛋白質(zhì)激發(fā)子5，是一種E3泛素蛋白連接酶，包含N-端跨膜結(jié)構(gòu)域和C3H2C3型RING-H2 finger，是E2泛素結(jié)合酶的結(jié)合位點，通過泛素Lys48殘基催化多聚泛素化蛋白。N-乙酰殼寡糖激發(fā)子可快速誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)的合成。EL5于水稻根系原始形成后，在維持細(xì)胞活力方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它還作為一種抗細(xì)胞壞死酶，介導(dǎo)植物激素作用后根細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性蛋白的降解。此外，EL5通過RING-H2 finger與水稻泛素載體蛋白UBC5b相互作用[11]。接種大豆胞囊線蟲后的24 h是線蟲在寄主細(xì)胞中移動和建立取食位點的時間，也是線蟲與寄主斗爭最激烈的時間。本研究中熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，GmRHF1在接種大豆胞囊線蟲后48 h內(nèi)表達量顯著升高，推測該基因介導(dǎo)大豆與線蟲的不親和性互作反應(yīng)，其具體調(diào)控機制有待于進一步研究。