信建豪，張翠利，張利娟，王歡歡，李 錕

(黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063)

葡萄糖是生物體中新陳代謝不可缺少的能量物質(zhì)，其在生物體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)時所釋放出的能量是生物體生命活動的直接能量來源。如果人的胰島素分泌缺陷或生物作用受損，將引起糖尿病這種“不治之癥”，長期的高血糖將導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、血管、神經(jīng)的慢性損傷及功能障礙，給人類健康和生活帶來了極大影響[1]。目前，血液中葡萄糖的檢測方法主要有碘量法[2]、化學(xué)發(fā)光法[3]、高效液相色譜法[4]、酶法[5-6]等。其中酶法已成為居家診斷的常用方法，但其檢測血糖所用的酶價格較高，且還需血糖儀配合診斷。若能利用價格低廉的化學(xué)試劑代替酶，再應(yīng)用智能手機(jī)代替血糖儀，檢測成本將更加低廉，使用更方便。

分子印跡技術(shù)是指以待測目標(biāo)分子為模板分子，合成具有專一識別功能的分子印跡聚合物的一種技術(shù)，具有制備簡單、特異性好、可重復(fù)使用、穩(wěn)定性高、抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)等顯著優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分離、分析、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[7]。分子印跡的識別特異性，可用于模擬酶、抗體或抗原的專一性[8]識別，具有成本低廉，操作簡單，使用方便等優(yōu)點(diǎn)。

目前智能手機(jī)迅速發(fā)展，幾乎達(dá)到了“人手一部”的地步，智能手機(jī)易于攜帶、計算性能強(qiáng)、數(shù)據(jù)傳輸方便、軟硬件易于擴(kuò)展等優(yōu)勢，使之便于在疾病診斷方面進(jìn)行開發(fā)研究。相比于現(xiàn)階段常用的血糖儀，使用手機(jī)可減小設(shè)備的投入，降低成本；還可進(jìn)行數(shù)據(jù)共享，由專業(yè)檢驗(yàn)師在線數(shù)據(jù)分析，實(shí)現(xiàn)居家診斷，已成為一個十分令人關(guān)注的研究熱點(diǎn)[9-10]。如Pavla等[11]以氣泡膜為載體，將葡萄糖氧化酶和過氧化物酶固定至其表面，加入葡萄糖進(jìn)行氧化和鹽酸苯二胺顯色，最后用智能手機(jī)拍照，根據(jù)色度大小檢測葡萄糖含量。但該方法仍需使用酶。迄今，采用分子印跡技術(shù)制備檢測試紙，通過對目標(biāo)化合物進(jìn)行富集后，加入顯色劑進(jìn)行顯色，最后采用智能手機(jī)拍照和軟件GIMP 2.8色度識別，用以檢測目標(biāo)化合物含量的方法未見報道。本研究以葡萄糖為目標(biāo)分子，建立了分子印跡試紙富集后顯色，智能手機(jī)檢測血液中葡萄糖檢測的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FA1004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；KQ-300V型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；場發(fā)射掃描電鏡FEI Quanta 250FEG(美國FEI公司)；TU1810型紫外可見分光光度計(上海普析)；真空采血管、血細(xì)胞過濾器、4孔檢測板、醋酸纖維膜套裝購于上海金標(biāo)生物科技有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購于酷爾化學(xué)試劑公司；α-甲基丙烯酸、N,N-二亞甲基雙丙烯酰胺購于上海阿拉丁試劑有限公司；顯色劑由0.05 mL甲基橙指示劑、0.05 mL甲基紅指示劑、0.2 mL甲基紅-溴甲酚綠指示劑和2 mL 0.6 mg/mL硼酸混勻后超聲數(shù)秒制得。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 葡萄糖分子印跡檢測盒的制備精確移取25 μL功能單體α-甲基丙烯酸分別加入到5 mL 1.0 mg/mL的葡萄糖水溶液中，超聲混合10 min，加入0.041 0 g交聯(lián)劑(N,N-二亞甲基雙丙烯酰胺)，再超聲40 min后于5 ℃冰箱中靜置12 h。取出恢復(fù)至室溫后加入20 mg引發(fā)劑(過硫酸銨)，再超聲8 min即得粘稠狀的葡萄糖分子印跡聚合物。

圖1 葡萄糖分子印跡檢測盒Fig.1 Glucose molecule imprinted determination kit

將醋酸纖維素膜浸入制備的葡萄糖分子印跡聚合物中30 min后，置真空干燥箱中于45 ℃下干燥25 min。然后用打孔器將葡萄糖分子印跡聚合物的醋酸纖維素膜打出圓形小片，即得葡萄糖分子印跡試紙。將制備好的試紙置于4孔檢測板的空穴中，用純化水對反應(yīng)區(qū)進(jìn)行多次洗脫，直至采用硫酸-苯酚法檢測不出洗脫液中的葡萄糖，最后置于真空干燥箱內(nèi)于45 ℃干燥30 min，即得葡萄糖分子印跡檢測盒(圖1)。

1.2.2 葡萄糖測定方法在洗脫后的檢測盒反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加20 μL試樣溶液，靜置5 min后用100 μL氯仿洗滌反應(yīng)區(qū)(20 μL/次)，以清洗去除游離物質(zhì)。再滴加20 μL顯色劑于反應(yīng)區(qū)，靜置10 min使其反應(yīng)顯色。將檢測盒與智能手機(jī)放置于自制的手機(jī)拍照裝置中，對檢測盒中反應(yīng)區(qū)進(jìn)行拍照，然后用免費(fèi)軟件GIMP 2.8中的拾色器檢測孔中的紅色色度數(shù)據(jù)，以色度為測定值，代入工作曲線，計算試樣中的葡萄糖含量。

圖2 葡萄糖分子印跡試紙洗脫前(A)與洗脫后(B)的電鏡掃描圖Fig.2 SEM figures of glucose molecule imprint test paper befor(A) and after(B) elution

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖分子印跡材料設(shè)計

制備分子印跡材料的方法有本位聚合[12]、懸浮聚合[13]、表面印跡[14]、冰膠印跡[15]等，考慮到所制備的分子印跡試紙須有一定的韌性，避免在打孔、安裝時引起聚合材料破損從而影響結(jié)果的精密度,本文采用冰膠聚合法，以N,N-二亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑。實(shí)驗(yàn)考察了4-乙烯吡啶、α-甲基丙烯酸和丙烯酰胺常用的功能單體對測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以4-乙烯吡啶為功能單體時，生成的聚合物有顏色，干擾測定，以丙烯酰胺為功能單體時的吸附性能較差，而以α-甲基丙烯酸為功能單體時測定效果最佳。

2.2 葡萄糖分子印跡材料的形貌

采用場掃描電鏡對葡萄糖分子印跡試紙表面洗脫前后進(jìn)行掃描(圖2)。圖中的紋理由印跡材料聚合在試紙表面形成，比較發(fā)現(xiàn)洗脫后的葡萄糖試紙表面更為粗糙，說明洗脫對試紙表面產(chǎn)生了影響，使分子空穴產(chǎn)生。

2.3 吸附時間及吸附溫度的選擇

在5 mL 0.4 mg/mL葡萄糖溶液中加入一片葡萄糖印跡試紙，采用紫外分光光度計檢測溶液吸光度隨時間的變化。結(jié)果顯示，該方法制備的印跡試紙吸附5 min即達(dá)到平衡，計算得其吸附量(Q)為0.651 mg/片，因此選擇吸附時間為5 min。

在一系列5 mL 0.4 mg/mL葡萄糖溶液中分別加入一片葡萄糖印跡試紙，考察其在不同溫度下吸附5 min的吸光度，計算吸附量。結(jié)果顯示，當(dāng)溫度為30 ℃時，葡萄糖溶液的吸附量最大(Q=0.673 mg/片)。但在20～30 ℃之間，吸附量變化較小，為方便使用，選取在室溫下進(jìn)行測定。

圖3 葡萄糖試紙對葡萄糖(a)、肌酐(b)、谷氨酸(c)、牛血清白蛋白(d)和尿素(e)的吸附動力曲線Fig.3 The adsorption kinetics ofglucose(a),creatinine(b),glutamate(c),BSA(d) and urea(e) with glucose imprinted paper

圖4 手機(jī)拍照裝置示意圖Fig.4 Diagram of take pictures for mobile

2.4 特異識別性的研究

考察了血液中共存的物質(zhì)對血液中葡萄糖提取的影響，分別在5 mL 0.4 mg/mL的葡萄糖、尿素、肌酐、谷氨酸和白蛋白溶液中加入一片葡萄糖印跡試紙，測定其吸附量隨時間的變化曲線(圖3)，結(jié)果顯示，葡萄糖印跡試紙對尿素、谷氨酸和白蛋白的吸附量較小，對肌酐的吸附量較大，但采用5 min作為吸附時間時，對肌酐的選擇性系數(shù)也達(dá)到25倍，因此對葡萄糖的測定影響較小，表明葡萄糖試紙的特異性良好。

2.5 顯色劑的選擇

可使葡萄糖顯色的試劑有雜多酸[16]、3，5-二硝基水楊酸[17]、蒽酮[18]和鐵-鄰菲羅啉[19]等，但若要實(shí)現(xiàn)快速測定，需顯色反應(yīng)能夠快速、靈敏地發(fā)生。因此采用硼酸與葡萄糖的多羥基發(fā)生配位，生成酸性物質(zhì)，該反應(yīng)能夠快速、定量完成。生成的酸性物質(zhì)用指示劑進(jìn)行作用，使顏色發(fā)生變化。結(jié)果表明，以0.05 mL甲基橙、0.05 mL甲基紅、0.2 mL甲基紅-溴甲酚綠指示劑和2 mL 0.6 mg/mL的硼酸混勻經(jīng)超聲后制得的顯色劑與葡萄糖作用后產(chǎn)生的顏色僅有紅色，無雜色的干擾，且顯色速度快，因此采用上述組成配制顯色劑。

2.6 拍照影響因素考察

在拍照識別色度中，為避免光線和拍攝角度對測定結(jié)果的影響，本研究自制了手機(jī)拍照裝置(圖4)：將檢測盒置于暗盒中，用一個Led白色燈帶提供光源；手機(jī)放置在暗盒上面，攝相頭通過固定的孔進(jìn)行拍照來保持光線和角度的穩(wěn)定。為使條件更加一致，將2個4孔檢測盒同時置于暗盒中，使試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液同時顯色，消除操作誤差。

2.7 工作曲線

配制5 mL 10.0～1.00×10-7mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的一系列不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下測定，以GIMP 2.8軟件中拾色器采集的色度(H)為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度的負(fù)對數(shù)(pC)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，結(jié)果顯示，葡萄糖濃度的負(fù)對數(shù)與色度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為H=421-23.3pC，相關(guān)系數(shù)(r)為0.993，檢出限為5.7×10-7mg/mL。

2.8 精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1.00×10-5mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下測定其色度值，連續(xù)測定5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%(臨床分析要求RSD<10%)，并在6個月內(nèi)每日測定一次，計算得日間RSD為5.4%。表明本方法精密度良好，且在6個月內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 實(shí)際樣品測定與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取3只符合實(shí)驗(yàn)規(guī)格的家兔，將其固定，用靜脈血樣采集針刺破耳緣靜脈使血液流進(jìn)負(fù)壓管適量，取血后以棉球壓迫止血。然后將所得兔血用血細(xì)胞過濾器過濾后，取續(xù)濾液20 μL在優(yōu)化條件下測定，代入線性方程后計算血液中葡萄糖含量，并與羅氏家用血糖儀進(jìn)行對照(表1)。

分別取0.200、0.500、1.00 mg/mL葡萄糖溶液和等體積的實(shí)際血液樣品混勻，經(jīng)血細(xì)胞過濾器過濾后取20 μL加入葡萄糖分子印跡試紙，在優(yōu)化條件下考察其回收率(表1)。結(jié)果顯示，葡萄糖在3個加標(biāo)濃度下的回收率為91.8%～108%，RSD為8.2%～8.6%，表明本方法準(zhǔn)確度良好，與家用血糖儀結(jié)果無顯著性差異，可用于實(shí)際檢測。

表1 測定結(jié)果與回收率試驗(yàn)Table 1 Results of determination and recovry

3 結(jié) 論

本文以自制的葡萄糖印跡檢測盒作為血液中葡萄糖的分離、顯色裝置，配合智能手機(jī)的攝相頭進(jìn)行拍照，再采用免費(fèi)軟件GIMP 2.8檢測色度，實(shí)現(xiàn)了血液中葡萄糖的測定，該方法檢測速度快、吸附量大、選擇性高、成本低廉、操作方便，可為居家診斷及治療打下基礎(chǔ)。