杜青青，張平平，談 瓊，陳月丹

(1.齊魯醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，山東 淄博 255300；2.山東省高校生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 淄博 255300)

槲皮素(Quercetin)是最常見(jiàn)的一種生物活性的類黃酮化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉和中草藥中。槲皮素具有祛痰、降血壓血脂、保護(hù)心血管等作用，可用于慢性支氣管炎、高血壓和冠心病患者的臨床輔助治療。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素還具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等活性[1]。由于其廣泛的藥理活性，其常被作為各類中藥材的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，探索槲皮素的含量測(cè)定方法具有重要意義。目前槲皮素含量檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2]、毛細(xì)管電泳法(CE)[3]、電化學(xué)法(DPSV)[4]、熒光光度法(FS)[5-6]等。其中，基于納米探針的熒光分析法具有簡(jiǎn)便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究人員的廣泛關(guān)注，而傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)探針易對(duì)生物和環(huán)境造成有害影響[7]，因此，有必要開(kāi)發(fā)環(huán)境友好的熒光材料并建立一種簡(jiǎn)單、高效、靈敏檢測(cè)槲皮素的分析方法。

2006年，孫亞平等[8]通過(guò)激光燒蝕碳靶，經(jīng)硝酸氧化和聚乙二醇鈍化后，獲得熒光納米顆粒，并首次定義為碳點(diǎn)。碳點(diǎn)粒徑一般小于10 nm，是繼碳納米管、石墨烯和納米金剛石后出現(xiàn)的一種新型碳納米功能材料[9]。相較于有機(jī)染料和傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)，碳點(diǎn)不僅保持了碳基材料無(wú)毒、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，還具有水溶性優(yōu)異、光穩(wěn)定性好、易于功能化、價(jià)廉易得等特性[10]，在分析檢測(cè)[11-12]、生物成像[13-14]、藥物遞送[15]等眾多領(lǐng)域均表現(xiàn)出發(fā)展?jié)摿?。設(shè)計(jì)得到熒光效率高、功能基團(tuán)豐富的碳點(diǎn)可為槲皮素檢測(cè)提供新思路。劉春艷[16]課題組最先利用熱解法制備了量子產(chǎn)率47%的硅烷(AEAPMS)功能化碳點(diǎn)，通過(guò)包覆二氧化硅可將該非水溶性硅烷碳點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄约{米材料，用于細(xì)胞成像。該課題組[17]進(jìn)一步研究硅烷碳點(diǎn)自聚及與有機(jī)硅烷共聚，獲得了具有光限幅性能的透明熒光凝膠玻璃。研究表明，硅烷碳點(diǎn)可用作檢測(cè)探針。Chen等[18]分別將多種有機(jī)硅烷與水混合，300 ℃水熱反應(yīng)得到硅烷碳點(diǎn)，熒光效率可達(dá)42.6%，并成功用于溫度探針。Zou等[19]根據(jù)劉春艷課題組報(bào)道的熱解法合成硅烷碳點(diǎn)，研究了pH值、溫度、干擾物的影響，首次實(shí)現(xiàn)了槲皮素的高靈敏、選擇性檢測(cè)，檢出限為79 nmol/L。Song等[20]合成了硅烷碳點(diǎn)印跡熒光納米顆粒，用于玉米中玉米烯酮的檢測(cè)，檢出限為0.02 mg/ L。

本課題組前期以檸檬酸為碳源，硅烷偶聯(lián)劑KH792為表面包覆劑，一步水熱法制備了硅烷功能化碳點(diǎn)[21]。相較于熱解法，所得碳點(diǎn)具有熒光效率高(高達(dá)69.2%)、表面功能基團(tuán)豐富、水溶性好的優(yōu)勢(shì)，更有利于水溶液中槲皮素的檢測(cè)和靈敏度的提高。本工作研究了水熱硅烷碳點(diǎn)與槲皮素的相互作用，基于槲皮素對(duì)該碳點(diǎn)的熒光猝滅作用，建立了一種碳點(diǎn)納米熒光探針高靈敏檢測(cè)槲皮素的新方法，檢出限低至3.8 nmol/L，并進(jìn)行了自來(lái)水中槲皮素的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，相比于文獻(xiàn)進(jìn)一步提高了方法的靈敏度和實(shí)用性。同時(shí)，初步探討了槲皮素對(duì)該硅烷碳點(diǎn)的熒光猝滅機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100F型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；IR-21型傅立葉紅外光譜儀，UV-2250紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津儀器公司)；F-380型熒光分光光度計(jì)(港東科技有限公司)；酸度計(jì)(梅特勒-托利多有限公司)。

硅烷偶聯(lián)劑KH792(東莞市山一塑化有限公司)；槲皮素(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；檸檬酸、磷酸、硼酸、冰醋酸、氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.006 g槲皮素，加入10.0 mL無(wú)水乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容至刻度，得到400.0 μmol/L的槲皮素溶液，4 ℃保存待用，使用時(shí)逐級(jí)稀釋;pH 7.0伯瑞坦-羅賓森(BR)緩沖溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碳點(diǎn)的合成碳點(diǎn)制備采用本課題組前期報(bào)道的合成方法[21]：稱取0.5 g檸檬酸，加入10.0 mL水及10.0 mL硅烷偶聯(lián)劑KH792，待混合均勻后，將所得溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，電熱鼓風(fēng)干燥箱180 ℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束自然冷卻至室溫，得到澄清黃棕色液體。利用正已烷萃取3次，得最終碳點(diǎn)流體產(chǎn)物。前期研究發(fā)現(xiàn)高濃度碳點(diǎn)出現(xiàn)濃度猝滅效應(yīng)[20]，將所得產(chǎn)物用水稀釋400倍后待用。

1.2.2 碳點(diǎn)熒光猝滅檢測(cè)槲皮素在10 mL比色管中依次加入1.0 mL BR緩沖溶液、1.0 mL SiCDs溶液及不同量槲皮素溶液，用水稀釋至刻度并搖勻，靜置20 min，設(shè)定熒光分光光度計(jì)參數(shù)λex=360 nm，測(cè)定體系450 nm處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光強(qiáng)度變化ΔF=F0-F。(F0和F分別表示加入槲皮素前后體系的熒光強(qiáng)度)。

圖1 SiCDs的透射電鏡圖Fig.1 TEM image of SiCDs

圖2 SiCDs的紅外光譜Fig.2 FTIR spectrum of SiCDs

圖3 SiCDs的紫外吸收及熒光光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of SiCDs

2 結(jié)果與討論

2.1 SiCDs的表征

圖4 pH值對(duì)作用體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH value on fluorescence intensity of the system

2.2 槲皮素與SiCDs作用條件的優(yōu)化

2.2.1 pH值的優(yōu)化考察了pH值對(duì)SiCDs-槲皮素體系熒光強(qiáng)度的影響。如圖4所示，在pH 4.0～7.0時(shí)，SiCDs自身熒光隨pH值的增大而增強(qiáng)，之后趨于穩(wěn)定。當(dāng)體系pH 7.0時(shí)，ΔF較大，信噪比高，SiCDs與槲皮素在此條件下相互作用較強(qiáng)，且該pH值與生理?xiàng)l件接近，故實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0為緩沖溶液的最佳pH 值。

2.2.2 槲皮素與SiCDs作用時(shí)間的選擇考察了pH 7.0時(shí)，體系熒光強(qiáng)度隨作用時(shí)間的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入槲皮素5 min后，SiCDs熒光強(qiáng)度降低，20 min后趨于穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳作用時(shí)間為20 min。

圖5 不同濃度槲皮素存在下SiCDs的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of SiCDs upon addition of different quercetin concentrationsquercetin concentration(a-n):0,1.0,2.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0 μmol/L;insert:relationship between fluorescence quenching and quercetin concentration

2.2.3 SiCDs用量的選擇考察了SiCDs的不同加入量(0.01、0.1、1.0 mL)對(duì)SiCDs-槲皮素體系的影響。結(jié)果顯示，體系中加入1.0 mL SiCDs時(shí)，體系的響應(yīng)靈敏度最高，因此實(shí)驗(yàn)選擇SiCDs的最佳用量為1.0 mL。

2.3 槲皮素對(duì)SiCDs的熒光響應(yīng)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限在上述優(yōu)化條件下，研究了槲皮素對(duì)SiCDs熒光光譜的影響，并建立了SiCDs熒光強(qiáng)度變化與槲皮素濃度的線性響應(yīng)關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見(jiàn)，槲皮素對(duì)碳點(diǎn)具有熒光猝滅作用，且隨著槲皮素濃度的增大，SiCDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)槲皮素濃度在1.0～40.0 μmol/L時(shí)，SiCDs的熒光猝滅值與槲皮素濃度呈良好線性關(guān)系(內(nèi)插圖)，線性方程為ΔF=34.418C+24.732(ΔF=F0-F，C為槲皮素的濃度，單位為μmol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.996 7。該方法的檢出限(3.3δ/K)為3.8 nmol/L。對(duì)25.0 μmol/L槲皮素與SiCDs作用體系進(jìn)行6次平行測(cè)定，所得熒光強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%。說(shuō)明該方法具有較高的靈敏度和精密度，可滿足微量分析的要求。

2.3.2 干擾實(shí)驗(yàn)考察了常見(jiàn)陽(yáng)離子和常用輔料淀粉的存在對(duì)體系測(cè)定槲皮素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在槲皮素濃度為10.0 μmol/L時(shí)，可允許共存10倍濃度的淀粉，50倍濃度的Na+，100倍濃度的Ca2+、Zn2+、Mg2+、K+、Al3+，表明該方法具有較好的選擇性。

2.3.3 實(shí)際樣品的分析為了進(jìn)一步考察所建立方法的實(shí)用性，將該方法用于自來(lái)水中槲皮素的測(cè)定，并考察了3種不同加標(biāo)濃度(5.0、10.0、20.0 μmol/L)的回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)得方法的加標(biāo)回收率為91.5%～92.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.30%。測(cè)定結(jié)果表明該方法的RSD和加標(biāo)回收率均在可以接受的范圍內(nèi)，可用于實(shí)際樣品的分析。

2.3.4 不同槲皮素檢測(cè)方法的比較將本方法與文獻(xiàn)報(bào)道用于檢測(cè)槲皮素的方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。本方法具有較寬的線性范圍和很高的檢測(cè)靈敏度。

表1 不同槲皮素檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of different methods for determination of quercetin

2.4 熒光猝滅機(jī)制

為了研究槲皮素對(duì)SiCDs的熒光猝滅機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)考察了作用前后紫外吸收光譜的變化。如圖6所示，SiCDs在240 nm和360 nm處存在2個(gè)特征吸收峰，槲皮素在380 nm處存在特征吸收峰。二者相互作用后，在320 nm左右出現(xiàn)了新的吸收峰，該吸收峰既非SiCDs吸收峰，也不歸屬于槲皮素吸收峰。分析二者的結(jié)構(gòu)、紫外光譜和碳點(diǎn)紅外光譜可知，由于溶劑水的存在，SiCDs在形成過(guò)程中除了檸檬酸的羧基與硅烷氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)外，硅烷部分水解，使SiCDs表面修飾了以—NH2為端基的長(zhǎng)鏈基團(tuán)。由于槲皮素屬于弱酸，含有豐富的酚羥基，二者通過(guò)靜電作用，形成了新的共軛結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了吸收光譜的變化和SiCDs的熒光猝滅。而—NH2的存在有利于增強(qiáng)相互作用，進(jìn)而顯著提高了檢測(cè)靈敏度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步判斷作用機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅。

為進(jìn)一步確證猝滅機(jī)制，研究了不同溫度下槲皮素對(duì)SiCDs的熒光猝滅作用。依據(jù)Stern-Volmer方程F0/F=1+KSVC處理數(shù)據(jù)，F(xiàn)0和F分別為碳點(diǎn)與槲皮素作用前后的熒光強(qiáng)度，KSV為猝滅常數(shù)，C為槲皮素濃度。圖7為分別在25 ℃和45 ℃條件下所得SiCDs熒光強(qiáng)度與槲皮素濃度的關(guān)系曲線，均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.996 9和0.992 0，猝滅常數(shù)分別為0.017 8和0.016 1，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)體系只存在1種猝滅方式，且當(dāng)溫度升高時(shí)，猝滅常數(shù)減小。綜上，判斷槲皮素對(duì)SiCDs的猝滅機(jī)制主要為靜態(tài)猝滅。

圖6 SiCDs、槲皮素、碳點(diǎn)-槲皮素的紫外吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of SiCDs,quercetin and SiCDs-quercetin solution

圖7 不同溫度下槲皮素對(duì)SiCDs的猝滅效應(yīng)Fig.7 Quenching effect of quercetin on SiCDs at different temperatures

3 結(jié) 論

本文合成了具有豐富表面基團(tuán)的水溶性SiCDs，并以SiCDs為熒光探針建立了槲皮素的熒光分析方法，基于作用體系結(jié)構(gòu)和作用效應(yīng)分析，闡釋了熒光猝滅機(jī)制為槲皮素酚羥基與SiCDs表面堿性基團(tuán)靜電作用導(dǎo)致靜態(tài)猝滅。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，槲皮素濃度在1.0～40.0 μmol/L范圍內(nèi)與SiCDs熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，檢出限低至3.8 nmol/L，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。