潘 晨，王枚博，吳思霖，王欣美，于 建，張 凱，王 柯，鄭 榮

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

目前，化妝品中含溴防腐劑的檢測方法有高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[3-5]、高效液相色譜-電化學(xué)檢測法(HPLC-ECD)[6]和氣相色譜法(GC)[7]。這些方法存在一定不足，HPLC-UV法測定時在低波長附近的干擾大，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。HPLC-ECD法雖有較高靈敏度，但ECD檢測器對HPLC系統(tǒng)中存在的氧(空氣)非常敏感，易造成檢測器不穩(wěn)定[8]。GC法可分析在UV上無特異吸收峰的化合物，但本課題組在前期篩查中發(fā)現(xiàn)，部分含溴化合物(如溴氯芬)的響應(yīng)不理想，2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇的線性范圍窄。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)也僅對2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇的液相色譜測定法進行規(guī)定，其余4種防腐劑的檢測方法未作收錄。

高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)是近年來快速發(fā)展的一種非常適合元素形態(tài)分析的方法。該方法結(jié)合了HPLC的高效分離能力及ICP-MS的高靈敏特點，為溴及含溴化合物的測定提供了強有力的檢測手段[9-14]。本課題組前期建立了2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇的HPLC-ICP-MS測定法[15]，但其流動相的有機相比例超過5%時易造成ICP-MS錐孔堵塞甚至熄火。本文進一步建立了同時測定化妝品中5種含溴防腐劑的HPLC-ICP-MS法，通過引入氬氧混合氣作為ICP-MS的反應(yīng)氣，可實現(xiàn)流動相中高比例有機相分析，拓展了方法的適用范圍。該方法靈敏度高，準確性好，可用于化妝品中含溴防腐劑的快速篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DS-800DTH 型超聲儀(上海生析超聲儀器有限公司)；MS 3 basic 型渦旋儀(德國IKA公司)；5810R型離心機(德國 Eppendoff公司)；Milli-Q Reference A+型超純水儀(德國 Millipore公司)。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸，B為甲醇，梯度洗脫程序：0～3 min，75%A；3～8 min，75%～40%A；8～10 min，40%～0%A；10～13 min，0%A；13～14 min，0%～75%A；14～15 min，75%A；流速為1.0 mL·min-1，柱溫為室溫，進樣體積為10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件射頻功率：1 550 W；采樣深度：10.0 mm；載氣流量：0.7 L·min-1；冷卻氣流速：15.0 L·min-1；反應(yīng)氣比例：17%，反應(yīng)氣為氬氧混合氣(體積比4∶1)；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.40 r/s；霧化室溫度：-2 ℃；采集質(zhì)量數(shù)：79Br；碰撞反應(yīng)模式，氦氣流速：4.0 mL·min-1；采用 TRA模式，積分時間：0.5 s，采集時間：960 s。采用有機進樣專用炬管。

1.3 標準儲備溶液的制備

1.4 樣品前處理

稱取樣品1.0 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入含0.1%(體積分數(shù))甲酸的甲醇溶液10 mL，充分渦旋振蕩混勻，超聲提取20 min，靜置至室溫，以10 000 r/min離心5 min，取適量上清液過0.22 μm濾膜，濾液備用。同時進行空白實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 ICP-MS條件的優(yōu)化

由于Br的電離能較高，其在 ICP-MS上的靈敏度比其它元素低，為獲得含溴化合物的最佳響應(yīng)值，在1 300～1 600 W范圍內(nèi)對射頻功率進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，射頻功率對目標分析物靈敏度的影響較為顯著，響應(yīng)值隨著射頻功率的增大而增強，當(dāng)射頻功率大于1 550 W時響應(yīng)值增加不明顯，因此選擇最佳射頻功率為1 550 W。

本實驗在梯度洗脫時有機相比例達100%，可能導(dǎo)致ICP-MS信號不穩(wěn)定，并且有機相分解產(chǎn)生的碳粉亦可能導(dǎo)致ICP-MS錐口堵塞而熄火。通過引入氬氧混合氣(體積比4∶1)作為反應(yīng)氣[16-17]，使有機物與氧氣燃燒，可消除炬管和錐孔的碳沉積。實驗發(fā)現(xiàn)，目標分析物的響應(yīng)隨著反應(yīng)氣加入量的增大而降低，可能是因為氧氣過多不利于等離子體的維持。當(dāng)反應(yīng)氣比例為17%時，既能夠有效消除積碳，且能達到較高的靈敏度。此外，通過降低霧化器的制冷溫度至-2 ℃，可降低有機溶劑的蒸氣壓，減少其到達等離子體炬焰的量，從而消除積碳。最終優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.2.2”所示。

2.2 同位素的選擇

在質(zhì)量數(shù)選擇方面，Br的測定可以選擇79Br(50.54%)和81Br(49.46%)兩個同位素[10]。Br的質(zhì)譜分析主要為多原子干擾，受Ar 的干擾明顯，其中40Ar40Ar1H 干擾81Br的測定，40Ar38Ar1H干擾79Br 的測定。由于38Ar的相對豐度(0.063%)遠低于40Ar(99.600%)，故40Ar38Ar1H 對79Br的干擾遠小于40Ar40Ar1H對81Br的干擾。而在標準品和樣品的測定中，79Br的基線噪音也優(yōu)于81Br，因此選擇79Br作為測量同位素。

圖1 3種提取溶劑對凝膠類樣品提取效果的比較Fig.1 Comparison of extraction efficiencies for gel samples by three solvents1.benzalkonium bromide；2.2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol；3.5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane；4.methyldi-bromo glutaronitrile；5.bromochlorophene

圖2 5種含溴防腐劑混合標準溶液(50 mg/L)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of five bromine contained preservatives standard solution(50 mg/L)the numbers denoted are the same as those in Fig.1

2.3 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了甲醇-水和乙腈-水2種流動相的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈為有機相時更易產(chǎn)生積碳且信號不穩(wěn)定，這是由于乙腈含碳比例高所致，因此選擇甲醇為有機相。進一步比較了甲醇-水、0.1%甲酸-甲醇兩種流動相，發(fā)現(xiàn)采用0.1%甲酸-甲醇梯度洗脫可提高待測成分的響應(yīng)，峰形尖銳，因此選擇0.1%甲酸-甲醇作為流動相。

2.4 提取溶劑的選擇

根據(jù)目標化合物的極性，分別考察了甲醇、90%甲醇水溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液作為提取溶劑對5種目標化合物的提取效果。結(jié)果顯示，液態(tài)水基類、膏霜乳液類樣品均能很好地分散于上述3種溶劑中，提取回收率均在90%以上，且差異不明顯。但對于凝膠類樣品，采用甲醇和90%甲醇水溶液提取時，溴氯酚的回收率均低于70%，而改用0.1%甲酸的甲醇溶液提取時，其回收率得到顯著改善，且5種化合物的回收率均在90%以上(圖1)。故最終選用含0.1%甲酸的甲醇溶液作為提取溶劑。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

精密移取適量1 000 mg/L的混合標準儲備溶液，用流動相逐級稀釋，配制成5種含溴防腐劑質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100 mg/L的混合標準系列工作溶液。取上述溶液10 μL進樣測定，以各待測物的峰面積(y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，mg/L)繪制標準曲線。由表1可知，5種含溴防腐劑均在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。50 mg/L混合標準溶液的色譜圖見圖2。

篩選液態(tài)水基類、膏霜乳液類、凝膠類陰性樣品，各稱取1.0 g，添加混合標準儲備溶液適量，按本方法進行前處理并測定。信噪比(S/N)為3時，得到方法的檢出限(LOD)為1.5～3.0 μg/g(見表1)。其中，本方法對2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇的檢出限(3.0 μg/g)遠低于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中高效液相色譜法的檢出限(300 μg/g)。

表1 5種含溴防腐劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients and limits of detection of five bromine contained preservatives

2.6 準確度與精密度

取液態(tài)水基類、膏霜乳液類、凝膠類陰性樣品各1.0 g，平行6份，分別加入不同體積的混合標準儲備溶液，按照本方法進行前處理并測定，方法的回收率和相對標準偏差(RSD)見表2。由表2可知，5種含溴防腐劑的回收率為91.2%～108%，RSD(n=6)為1.3%～4.2%，表明本方法的準確度和精密度較高。

表2 回收率與重復(fù)性實驗結(jié)果Table 2 Results of spiked recovery and repeatability test

圖3 典型樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of a typical sample1.benzalkonium bromide；2.2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol

2.7 實際樣品的測定

針對陽性樣品，采用現(xiàn)有國標方法[2]與本方法進行對比。由于苯扎溴銨尚無國標檢測方法，故僅對2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇作方法比較。結(jié)果表明，采用本方法測得護手霜和兒童潤膚乳中2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇的含量分別為0.020%和0.039%，國標方法測得的含量分別為0.021%和0.041%。兩種方法測定結(jié)果的相對偏差小于5%，說明本方法具有較高的準確性。

3 結(jié) 論