李盛菘，鄭永超,2，鐘近藝,2，趙沖林，2*

(1.中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院 防化研究院，北京 102205；2.國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

對(duì)事件現(xiàn)場(chǎng)采集的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確分析鑒定是可為驗(yàn)證是否存在化學(xué)毒劑使用提供最有力證據(jù)，但事故現(xiàn)場(chǎng)殘留的樣品往往會(huì)隨著時(shí)間和環(huán)境影響逐步分解和消失，因此對(duì)現(xiàn)場(chǎng)殘存的超痕量樣品及其降解產(chǎn)物的富集和提純是成功完成分析鑒定任務(wù)的關(guān)鍵。目前使用的萃取和濃縮前處理手段，存在背景干擾大、富集倍數(shù)低等問(wèn)題，給后續(xù)儀器分析造成困難，尤其是在有大量化合物干擾、樣品濃度極低的情況下，使用常規(guī)取樣分析方法可能無(wú)法檢出。分子印跡技術(shù)是一種高選擇性識(shí)別技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于異構(gòu)體和對(duì)映體的分離提純[1-3]、特定分子的傳感識(shí)別[4-6]、痕量組分的分離富集[7-10]等諸多領(lǐng)域。甲基膦酸哪酯(O-Pinacolyl methylphosphonic acid，PMPA)是化學(xué)毒劑梭曼的降解產(chǎn)物，也是合成毒劑的前體，屬于公約附表2B化學(xué)品[11]。本文通過(guò)研究甲基膦酸哪酯的特征官能團(tuán)，從微觀層面揭示了甲基膦酸哪酯分子與功能單體分子的作用機(jī)理，通過(guò)預(yù)組裝體系設(shè)計(jì)，合成出對(duì)甲基膦酸哪酯具有特征識(shí)別作用的分子印跡聚合物，將該分子印跡聚合物制備成固相萃取小柱，成功應(yīng)用于復(fù)雜樣品中超痕量甲基膦酸哪酯的分離富集和分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)硅烷化試劑(純度≥98%，美國(guó)Acros公司)；甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、二氯甲烷、甲醇、乙腈、氘代乙腈、四氯化碳(純度均大于98%，美國(guó)Aldrich)；偶氮二異丁腈(AIBN)、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(EGDMA)、丙酮、冰醋酸(分析純,北京化學(xué)試劑公司)；甲基膦酸哪酯(純度≥95%，軍事科學(xué)院防化研究院提供)。

GC 8000氣相色譜儀(配FPD-P檢測(cè)器，美國(guó)Thermo Fisher公司)；5975C型GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；VARIAN NMR SYSTEM 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian公司)；Spectrum GX FTIR System傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；JSM-6460電子顯微鏡(日本電子公司)；501A型恒溫水浴(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)；真空泵和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)；索氏萃取裝置(北京欣維爾公司)。

1.2 甲基膦酸哪酯預(yù)組裝分子印跡體系設(shè)計(jì)與合成

1.2.1 核磁共振波譜研究甲基膦酸哪酯與功能單體之間的相互作用以氘代乙腈為溶劑，配制50 mg/mL的甲基膦酸哪酯溶液，室溫下測(cè)定其31P{1H} NMR譜和1H NMR譜。與功能單體甲基丙烯酸(或丙烯酰胺)復(fù)配后，測(cè)定相應(yīng)的氫譜和磷譜。比較功能單體加入前后化學(xué)位移的變化。逐漸增加核磁管中反應(yīng)液的溫度(從室溫25 ℃直至聚合反應(yīng)時(shí)的溫度60 ℃)，研究溫度變化對(duì)分子間作用力的影響。

1.2.2 紅外光譜研究甲基膦酸哪酯與功能單體之間的相互作用以四氯化碳為溶劑，配制5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的甲基膦酸哪酯溶液，采用液膜制樣法，測(cè)定溶液的紅外光譜圖。與功能單體甲基丙烯酸(或丙烯酰胺)復(fù)配后，再次測(cè)定溶液的紅外光譜圖。比較功能單體加入前后的譜圖變化。

1.2.3 甲基膦酸哪酯預(yù)組裝分子印跡聚合物的合成在30 mL乙腈中加入10 mmol 甲基膦酸哪酯，再加入40 mmol功能單體，超聲10 min溶解，隨后于5 ℃下放置12 h。加入交聯(lián)劑EGDMA 200 mmol和1%引發(fā)劑AIBN。超聲20 min后將該混合溶劑倒入50 mL自制反應(yīng)瓶中，充入氮?dú)? min排氧，抽真空，密封。將反應(yīng)瓶置于60 ℃恒溫水中聚合反應(yīng)24 h，得到白色的棒狀聚合物。取出聚合物研磨，過(guò)80目篩，然后用丙酮反復(fù)沉降，除去過(guò)細(xì)粒子，再用甲醇-乙酸(9∶1，體積比)索氏提取24 h，最后用乙腈索氏提取12 h。將提取液濃縮20倍后在GC-MS選擇離子流模式下檢測(cè)模板分子的去除程度。取出分子印跡聚合物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃真空干燥30 min，得到干燥的分子印跡聚合物顆粒。

1.3 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物表征

1.3.1 表觀特性分別將未去除模板分子的聚合物和去除模板分子的聚合物用KBr壓片，測(cè)定紅外區(qū)4 000～400 cm-1下的吸收譜帶，研究印跡分子聚合物的官能團(tuán)特點(diǎn)。

將未去除模板分子的聚合物和去除模板分子的聚合物進(jìn)行噴金處理，用電子顯微鏡觀測(cè)聚合物的粒徑大小及形貌。

1.3.2 吸附特性準(zhǔn)確稱取一定量的分子印跡聚合物于4 mL螺口樣品小瓶中，加入一定體積的甲基膦酸哪酯溶液，振蕩，放置10 min。分析吸附后清液中剩余的甲基膦酸哪酯的濃度，根據(jù)吸附前后模板分子濃度的變化，計(jì)算出平均結(jié)合量Q，繪制吸附等溫線。

1.3.3 識(shí)別特性以甲基膦酸哪酯的同系物或結(jié)構(gòu)相近的化合物作為交叉選擇性的目標(biāo)化合物，并配制成一定濃度的樣品溶液。準(zhǔn)確稱取100 mg相應(yīng)的分子印跡聚合物于4 mL螺口樣品小瓶中。加入一定體積的交叉選擇性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩，放置10 min。取清液分析，根據(jù)吸附前后各種化合物的濃度變化計(jì)算吸附量，并用靜態(tài)分配系數(shù)和識(shí)別因子評(píng)價(jià)分子印跡聚合物的交叉選擇性。

1.4 分子印跡聚合物用于復(fù)雜樣品中痕量甲基膦酸哪酯的萃取分離

1.4.1 固相萃取小柱的制作在一支體積為30 mL的聚丙烯固相萃取小柱(63 mm×8.9 mm)中放入一孔徑為10 μm的聚乙烯篩板，準(zhǔn)確稱取300 mg的分子印跡聚合物填入其中，再放入一個(gè)相同尺寸的聚乙烯篩板固定，得到填充均勻、柱壓降適中的分子印跡聚合物固相萃取小柱，備用。普通硅膠萃取柱制備方法相同，只是填料為普通硅膠。

1.4.2 復(fù)雜樣品中痕量甲基膦酸哪酯的萃取分離將1 μg/mL甲基膦酸哪酯的乙腈溶液和相同目標(biāo)物濃度下加入1 mg/mL柴油干擾的乙腈溶液進(jìn)行硅烷化衍生，待GC-MS分析。取上述被干擾的樣品溶液2 mL，以“1.4.1”中制作的分子印跡固相萃取小柱進(jìn)行萃取分離，具體步驟為:將被干擾的乙腈溶液上樣后，采用5 mL二氯甲烷作淋洗劑，最后用2 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，將收集的洗脫液進(jìn)行衍生與分析操作。將分子印跡固相萃取小柱替換為普通硅膠填料固相萃取小柱進(jìn)行同樣的上樣-淋洗-洗脫-衍生-分析步驟。對(duì)比4個(gè)分析結(jié)果，考察分子印跡固相萃取對(duì)復(fù)雜樣品中痕量甲基膦酸哪酯的萃取分離能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子間作用力研究

2.1.1 從化學(xué)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)分子間作用力模板分子和功能單體在聚合前能否形成穩(wěn)定的復(fù)合物，是獲得高選擇性和高親和性分子印跡聚合物的關(guān)鍵。甲基膦酸哪酯分子中，氧原子核外層有6個(gè)電子，兩個(gè)2s軌道上有4個(gè)電子，另外2個(gè)孤電子占據(jù)p軌道。磷原子外層有5個(gè)電子，一個(gè)3s軌道上有2個(gè)電子，3個(gè)p軌道上有3個(gè)電子，另外有5個(gè)空的d軌道，與氧形成雙鍵時(shí)，磷進(jìn)行sp3雜化，呈四面體構(gòu)型，可形成4個(gè)δ鍵，其中1個(gè)與氧上的2px形成1個(gè)δ鍵，另外3個(gè)和烷基及烷氧基形成3個(gè)δ鍵。磷具有利用3d空軌道成鍵的能力，與氧的2pz軌道形成d-p的π鍵，這樣在磷和氧之間形成1個(gè)δ和1個(gè)π鍵的雙鍵，但是磷的電負(fù)性(2.1)遠(yuǎn)小于氧的電負(fù)性(3.5)，這就造成電子云向氧一側(cè)靠近[12]，因此氧上帶有的部分負(fù)電荷，可以和親電試劑形成氫鍵。同時(shí)，甲基膦酸哪酯分子中還含有1個(gè)羥基，整體顯示酸性(PKa=4.7)，羥基上的氫也可以和電負(fù)性強(qiáng)的化合物形成氫鍵或者離子鍵。圖1為甲基膦酸哪酯與甲基丙烯酸形成氫鍵、與丙烯酰胺形成離子鍵的示意圖。

圖1 甲基膦酸哪酯與功能單體之間的成鍵示意圖Fig.1 Bonding diagram between O-pinacolyl methylphosphonic acid and functional monomer moleculesleft:methylacrylic acid,right:acrylamide(左為甲基丙烯酸，右為丙烯酰胺)

2.1.2 從化學(xué)位移研究分子間作用力圖2左圖為甲基膦酸哪酯在氘代乙腈(左A)，以及在氘代乙腈中跟丙烯酰胺(AM，左B)、甲基丙烯酸(MAA，左C)混合時(shí)的31P{1H}NMR譜。結(jié)果顯示，在氘代乙腈溶液中磷的化學(xué)位移是33.973，加入功能單體AM后，因AM中的氮原子提供了電子，形成離子鍵，增加了磷原子周?chē)碾娮釉泼芏?，起到屏蔽作用，使磷的化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)至32.802；而加入功能單體MAA后，因氫鍵的形成，磷核周?chē)碾娮釉泼芏冉档?，起到去屏蔽作用，化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)至35.721。圖2右圖A為甲基膦酸哪酯的1H NMR譜，測(cè)定結(jié)果和31P{1H}NMR一致;在功能單體AM加入后，甲基膦酸哪酯上的活潑氫，因與AM的氮作用而消失(右圖B)；而加入MAA后形成氫鍵，平均化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)了近6個(gè)化學(xué)位移單位(右圖C)。

另外，體系溫度升高到60 ℃，化學(xué)位移基本不變。即在加熱增加分子運(yùn)動(dòng)能量時(shí)，分子間的這種作用力相對(duì)固定。

2.1.3 從振動(dòng)頻率研究分子間作用力紅外光譜上，磷氧雙鍵伸縮振動(dòng)頻率依賴于磷上的取代基[13]，由π常數(shù)表示：

νP=O=930 + 40∑π

(1)

查表得πCH3=2.1,πO-CH2=2.85，πOH=1.9，代入上式得νP=O為1 204。

圖2 甲基膦酸哪酯的31P{1H}NMR譜(左)和1H NMR譜(右)Fig.2 31P{1H}NMR spectroscopy(left) and 1H NMR spectroscopy(right) of O-pinacolyl methylphosphonic acidA.the deuterated acetonitrile solution of O-pinacolyl methylphosphonic acid(0.33 mol/L);B.the deuterated acetonitrile solution of O-pinacolyl methylphosphonic acid(0.33 mol/L) and acrylamide( AM) functional monomer molecule(1.33 mol/L);C.the deuterated acetonitrile solution of O-pinacolyl methylphosphonic acid(0.33 mol/L) and methylacrylic acid(MAA) functional monomer molecule(1.33 mol/L)(A.甲基膦酸哪酯的氘代乙腈溶液(0.33 mol/L);B.甲基膦酸哪酯在氘代乙腈中(0.33 mol/L)與單體AM(1.33 mol/L)混合；C.甲基膦酸哪酯在氘代乙腈中(0.33 mol/L)與單體MAA(1.33 mol/L)混合)

圖3 甲基膦酸哪酯的FT-IR譜Fig.3 FT-IR spectroscopy of O-pinacolyl methylphosphonic acidA.O-pinacolyl methylphosphonic acid in carbon tetrachloride;B.O-pinacolyl methylphosphonic acid in carbon tetrachloride with acrylamide(AM) functional monomer molecule;C.O-pinacolyl methylphosphonic acid in carbon tetrachloride with methylacrylic acid(MAA) functional monomer molecule(A.在四氯化碳中；B.在四氯化碳中與單體AM混合；C.在四氯化碳中與單體MAA混合)

2.2 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物表征

2.2.1 形貌表征按“1.2.3”合成的甲基膦酸哪酯預(yù)組裝分子印跡聚合物(AM為單體)為白色的棒狀聚合物，經(jīng)研磨過(guò)篩，用甲醇-乙酸(9∶1,體積比)索氏提取24 h除去模板分子，得到甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物顆粒。

掃描電鏡結(jié)果顯示，所得分子印跡聚合物為粒徑幾十微米的顆粒(圖4A)。將其中一個(gè)顆粒局部表面分別放大至2萬(wàn)倍和5萬(wàn)倍，發(fā)現(xiàn)其為多孔性材料(圖4B、C)，這些孔使分子印跡聚合物的比表面積大大增加，從而增加了孔壁表面印跡點(diǎn)位的數(shù)量。

2.2.2 紅外光譜表征采用傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定以AM為功能單體合成的未去除模板分子的聚合物和去除模板分子的聚合物(KBr壓片法)在4 000～400 cm-1下的吸收譜帶，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物的吸收光譜圖Fig.5 Absorption spectra of O-pinacolyl methylphosphonic acid-imprinted polymerA.with template molecule;B.without template molecule(A.未去除模板分子；B.去除模板分子);AM as monomer

2.2.3 吸附特性表征實(shí)驗(yàn)對(duì)功能單體為MAA的甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物2P3、功能單體為AM的甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物2P5及空白分子印跡聚合物2P4進(jìn)行了研究。分別配制5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、80.0、150、200 μg/mL的甲基膦酸哪酯乙腈溶液。準(zhǔn)確稱取200 mg 分子印跡聚合物8份于4 mL螺口樣品小瓶中，分別加入上述8種不同質(zhì)量濃度的模板分子溶液2 mL，振蕩，放置10 min后取清液1 mL，衍生，加入內(nèi)標(biāo)，以GC-MS分析吸附后清液中剩余的甲基膦酸哪酯的濃度，計(jì)算出結(jié)合量Q，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物對(duì)模板分子的吸附量隨濃度的變化Table 1 The dependence of absorption capacity of O-pinacolyl methylphosphonic acid-imprinted polymer on template molecule on concentration

以起始濃度為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，作2P3、2P5和2P4的吸附等溫線，見(jiàn)圖6。從吸附等溫線上看，隨著模板分子質(zhì)量濃度逐漸增加，2P4和2P5都有吸附飽和的趨勢(shì)，而2P3沒(méi)有明顯的飽和現(xiàn)象，出現(xiàn)非特異性吸附，分子印跡聚合物2P5的吸附量比2P4大。另外，甲基膦酸哪酯質(zhì)量濃度低于80.0 μg/mL時(shí)，2P5對(duì)模板分子呈現(xiàn)一定的線性結(jié)合，而2P4的線性不明顯。說(shuō)明在2P5合成過(guò)程中，甲基膦酸哪酯與AM形成了復(fù)合物，當(dāng)洗脫甲基膦酸哪酯后在聚合物內(nèi)部形成了形狀與官能團(tuán)位置均與甲基酸頻哪酯相匹配的空穴，甲基膦酸哪酯能與這些空穴發(fā)生選擇性結(jié)合，在空穴被全部結(jié)合之前，結(jié)合是線性的，空穴全部被甲基膦酸哪酯分子占據(jù)后，呈非選擇性吸附，直到吸附達(dá)到飽和。2P4由于沒(méi)有這樣的空穴，僅呈非選擇性結(jié)合模式，結(jié)合量少。

圖6 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物的吸附等溫線Fig.6 Absorption isotherms of O-pinacolyl methylphosphonic acid-imprinted polymermonomer molecules are methacrylic acid for 2P3,acrylamide for 2P5 and acrylamide for non-imprinted sol-gel polymer 2P4(2P3功能單體為甲基丙烯酸，2P5功能單體為丙烯酰胺，2P4為空白印跡聚合物)

以選擇性結(jié)合作用的分子印跡聚合物2P5進(jìn)行Scatchard模型分析[14]。Scatchard模型表達(dá)式為：

Q/Ce=(Qmax-Q)/Kd

(2)

圖7 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物的Scatchard分析圖Fig.7 Scatchard diagram of O-pinacolyl methylphosphonic acid-imprinted polymer

其中，Q是吸附量，μg/g;Ce是吸附平衡時(shí)的模板質(zhì)量濃度，μg/L；Qmax是結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合數(shù)，μg/g；Kd是結(jié)合位點(diǎn)的平衡常數(shù)，μg/L。以Q/Ce為縱坐標(biāo)，Q為橫坐標(biāo)作圖，其Scatchard分析圖見(jiàn)圖7，在低吸附量范圍內(nèi)(Q<500 μg/g)兩者呈明顯線性相關(guān)。

將表1中的低吸附范圍數(shù)據(jù)代入公式(2)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Q/Ce=147-0.222 1Q。即-1/Kd=-0.222 1，計(jì)算得解離常數(shù)Kd=4.5×10-3μg/L，由Qmax/Kd=147，得最大表觀結(jié)合量Qmax,AM=661 μg/g。下文均以AM為單體合成的分子印跡聚合物為對(duì)象進(jìn)行研究。

2.2.4 選擇特性表征選擇性吸附是印跡聚合物最顯著的特征之一，分子印跡聚合物洗脫模板分子后留下了與其形狀與結(jié)合部位相對(duì)應(yīng)的空穴，此空穴可對(duì)模板分子進(jìn)行選擇性識(shí)別?？捎渺o態(tài)吸附分配系數(shù)Kp和識(shí)別因子α來(lái)表征[15]印跡聚合物的選擇性。

(3)

式中，Cp表示模板分子在印跡聚合物上的吸附量(μg/g)，Cs則表示底物在溶液中的質(zhì)量濃度(μg/mL)。識(shí)別因子α定義為：

(4)

其中Kpi和Kpj分別表示i物質(zhì)和j物質(zhì)的靜態(tài)吸附分配系數(shù)。j一般表示模板分子，而i為一般底物，即被用來(lái)評(píng)價(jià)分子印跡聚合物識(shí)別特性的其它物質(zhì)。

表2 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物對(duì)8個(gè)底物的靜態(tài)吸附分配系數(shù)及識(shí)別因子Table 2 Static adsorption distribution coefficient and identification factor of O-pinacolyl methylphosphonic acid-imprinted polymer on eight substrates

2.3 甲基膦酸哪酯分子印跡聚合物用于分離提純

3 結(jié) 論