劉琳

（中安聯(lián)合煤化有限責(zé)任公司，安徽淮南232001）

葉酸（FA）是人體健康生長(zhǎng)活動(dòng)必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)機(jī)體有著重要作用，適當(dāng)補(bǔ)充葉酸能減少畸形兒的出生，預(yù)防兒童腎衰，減少癌癥風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防老年癡呆，提高男性生育力，有益于記憶力和心血管健康[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)不同制劑、不同食品中葉酸含量開展研究，開發(fā)了多種葉酸含量測(cè)定的方法，如高效液相色譜法、紫外分光光度法、比色法、離子對(duì)色譜法等[2-11]。

上述測(cè)定方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，而熒光分析法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，選擇性高，特別適合微量或痕量物質(zhì)的定性、定量測(cè)定和有機(jī)物質(zhì)的分析。雖然熒光分析法測(cè)定葉酸的含量已有報(bào)道，但是基于葉酸對(duì)吖啶紅-羅丹明B體系的熒光猝滅作用，建立的測(cè)定制劑中葉酸含量的方法還未見報(bào)道。因此本文研究了吖啶紅-羅丹明B體系對(duì)葉酸的測(cè)定，建立了葉酸含量測(cè)定的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度儀（日立，日本島津株式會(huì)社）；AL204分析天平（梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司）；雷磁pHS-25數(shù)顯pH計(jì)（上海分析儀器廠）。試劑均為市售分析純，標(biāo)準(zhǔn)溶液及緩沖溶液均按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)配制。

1.2 熒光光譜的繪制

在10 mL比色管中加入0.5 mL吖啶紅溶液后，加入少量蒸餾水稀釋，再定容至刻度，搖勻。放置5 min后，測(cè)定其熒光光譜，確定最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。用相同的方法分別測(cè)定羅丹明B溶液、羅丹明B-吖啶紅溶液體系以及吖啶紅-羅丹明B溶液-葉酸的熒光光譜，確定其最大激發(fā)波長(zhǎng)、最大發(fā)射波長(zhǎng)。結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1 吖啶紅激發(fā)光譜

圖2 羅丹明B激發(fā)光譜

圖3 羅丹明B-吖啶紅體系激發(fā)光譜

圖4 發(fā)射光譜（a：吖啶紅，b：羅丹明B，c:羅丹明B-吖啶紅體系）

由圖可知，吖啶紅的最大激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，熒光峰波長(zhǎng)為528 nm；羅丹明B的最大激發(fā)波長(zhǎng)為535 nm，吸收峰波長(zhǎng)為578 nm，吖啶紅的熒光峰波長(zhǎng)距離與羅丹明B的吸收峰波長(zhǎng)較為相近，這為以吖啶紅作為能量給予體，羅丹明B為能量接受體建立的能量轉(zhuǎn)移體系提供了前提條件。且由圖3可知，吖啶紅-羅丹明B混合體系的最大激發(fā)波長(zhǎng)λmax為490 nm，因此實(shí)驗(yàn)選擇用最大激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm去激發(fā)吖啶紅與羅丹明B的混合體系，結(jié)果如圖4，兩種染料之間發(fā)生有效的能量轉(zhuǎn)移，且能量轉(zhuǎn)移效果較好。

在確定實(shí)驗(yàn)條件后，建立了AR-RB熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測(cè)定制劑中葉酸含量的方法。圖5和圖6分別為加葉酸后體系的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，表明加入葉酸后并未改變體系的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。如圖6所示，用最大激發(fā)波長(zhǎng)490 nm去激發(fā)AR-RB混合體系時(shí)，隨著葉酸濃度增加，578 nm處混合體系的能量逐漸減弱，且熒光強(qiáng)度減弱的程度與葉酸的濃度具有一定的線性關(guān)系。

圖5 加入葉酸后體系的激發(fā)光譜

圖6 （1為吖啶紅-羅丹明B體系，2-5分別為加入不同濃度葉酸后的曲線）

2 結(jié)果與討論

2.1 能量給體和受體濃度的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在5×10-6mol·L-1吖啶紅溶液中分別加入不同濃度的羅丹明B后，用最大激發(fā)光譜λmax=490 nm去激發(fā)體系，在發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm處，吖啶紅的熒光強(qiáng)度比單獨(dú)存在時(shí)明顯下降，而578 nm處羅丹明B的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。當(dāng)吖啶紅與羅丹明B的摩爾濃度比為1∶2時(shí)，體系的能量轉(zhuǎn)移效率最大，且加入定量葉酸，體系熒光猝滅明顯，靈敏度高，線性范圍較寬，有利于含量測(cè)定。因此，綜合考慮靈敏度和線性范圍，實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mL濃度為1.0×10-5mol/L吖啶紅溶液和1.0 mL濃度為1.0×10-5mol/L羅丹明B溶液，建立能量轉(zhuǎn)移體系。

2.2 表面活性劑的影響（圖7）

本實(shí)驗(yàn)研究了十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）對(duì)能量轉(zhuǎn)移體系的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDS、TTAB對(duì)體系的熒光強(qiáng)度影響不大，但當(dāng)加入一定量SDBS時(shí)，體系熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而且當(dāng)加入一定量SDS后體系穩(wěn)定性變差，故本實(shí)驗(yàn)選用SDBS作為體系的表面活性劑。

圖7 表面活性劑的影響

分別加入 SDS、SDBS、TTAB 濃度為 0 mol／L、0.1 mol／L、0.3 mol／L、0.5×10-2mol／L后，能量轉(zhuǎn)移體系熒光強(qiáng)度改變，如圖7所示。當(dāng)SDBS濃度為3×10-3mol/L時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，且△F的值穩(wěn)定，并大于其他表面活性劑下的△F。因此選擇十二烷基苯磺酸鈉的濃度為3×10-3mol/L。

2.3 溶液pH的影響

固定其他實(shí)驗(yàn)條件，用不同緩沖溶液來調(diào)節(jié)體系的pH值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8，最后優(yōu)選在蒸餾水的中性條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖8 pH的影響

2.4 反應(yīng)溫度的影響

圖9 為實(shí)驗(yàn)條件下反應(yīng)溫度在10℃～40℃時(shí)對(duì)△F值的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)反應(yīng)溫度過高或過低時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度△F會(huì)減小，在室溫下，△F值達(dá)到最大，靈敏度較高，且體系的熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)是在室溫下進(jìn)行的。

圖9 反應(yīng)溫度的影響

2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法分析了60 min內(nèi)△F隨反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10?！鱂隨著反應(yīng)的進(jìn)行隨之增加，但反應(yīng)5 min后，△F基本保持不變，且在5～60 min內(nèi)保持穩(wěn)定，可判斷該反應(yīng)基本完全。因此，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為5 min。

圖10 反應(yīng)時(shí)間的影響

2.6 共存物質(zhì)的影響

其他實(shí)驗(yàn)條件均不變，當(dāng)FA濃度為1.0×10-5mol/L時(shí)，考查了多種常見金屬離子、其他水溶性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾情況，結(jié)果表明：當(dāng)允許誤差為±5%時(shí)，150倍的 Ca2+、K+、Zn2+對(duì)實(shí)驗(yàn)無干擾；300 倍的 Na+、Fe2+、Ba2+、SO42-、Cl-、葡萄糖、Vtamin C 對(duì)葉酸的測(cè)定無干擾，說明該方法具有較好的選擇性。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照實(shí)驗(yàn)方法，改變?nèi)~酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖11），其線性回歸方程ΔF=965.6c+33.267（△F代表熒光強(qiáng)度猝滅值，c代表葉酸濃度，單位為10-5mol/L），線性相關(guān)系數(shù)R=0.998 9，葉酸濃度在5×10-6～2.5×10-5mol/L范圍內(nèi)與ΔF呈線性關(guān)系。對(duì)1.0×10-5mol/L，1.5×10-5mol/L，2.0×10-5mol/L 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，得到 RSD%分別為0.92%、0.64%、0.87%（n=5）；在1.0×10-5mol/L處平均回收率為97.79%。該方法的精密度和準(zhǔn)確度較好。

圖11 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.8 葉酸樣品含量測(cè)定、精密度以及回收率測(cè)定

2.8.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取新配葉酸樣品溶液1 mL，按照實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定5次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

2.8.2 樣品回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取葉酸樣品溶液1.00 mL于10 mL比色管中，再向比色管中加入1.00 mL葉酸對(duì)照品溶液，定容至刻度，配制得樣品溶液。測(cè)定葉酸含量，計(jì)算回收率，根據(jù)表2可得平均回收率為99.39%。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)

2.8.3 樣品溶液的測(cè)定

精密量取樣品液1 mL于10 mL比色管中，按照實(shí)驗(yàn)方法平行實(shí)驗(yàn)6次，根據(jù)每次所得樣品熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并代入線性回歸方程中求得樣品溶液中葉酸的含量，得到如下結(jié)果：葉酸的含量相當(dāng)于標(biāo)示量的99.47%，RSD約為0.74%。與采用高效液相色譜法（藥典方法）測(cè)定出的含量（100.20%，RSD為0.66%，n=5）結(jié)果一致。

3 結(jié)論

AR-RB熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測(cè)定制劑中葉酸的含量效果較好。采用十二烷基苯磺酸鈉溶液，在中性條件下，吖啶紅與羅丹明B之間能發(fā)生有效的能量轉(zhuǎn)移，隨著葉酸的加入，體系熒光強(qiáng)度逐漸減弱，在此基礎(chǔ)上可測(cè)定葉酸的含量。

按照本文方法測(cè)定制劑中葉酸的含量，可得葉酸的含量相當(dāng)于標(biāo)示量的99.47%，RSD約為0.74%，回收率為99.39%，與藥典方法測(cè)得的含量（100.20%，RSD為0.66%，n=5）結(jié)果一致。

使用AR-RB熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測(cè)定制劑中葉酸含量，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度良好，結(jié)果令人滿意。