董文科 ，陳春艷，馬暉玲*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是栽培面積最廣的多年生豆科牧草之一，其品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)成分豐富、適口性佳且易于栽培，被譽(yù)為“牧草之王”[1]。但隨著苜蓿種植面積的不斷擴(kuò)大，苜蓿蟲害日趨嚴(yán)重，其不僅減少牧草產(chǎn)量，降低飼草品質(zhì)，且影響光合作用，傳播病毒，降低苜蓿對水分和養(yǎng)分的利用率[2-3]。據(jù)報道，苜蓿蟲害嚴(yán)重發(fā)生時草產(chǎn)量下降25%～50%[4]。然而，目前抗蟲紫花苜蓿栽培品種較少，實際生產(chǎn)中主要以化學(xué)防治為主[5]。因此，利用基因工程手段培育綜合性狀優(yōu)良的抗蟲品種十分迫切。

目前，在抗蟲基因工程中經(jīng)常使用的基因主要包括蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、植物凝集素基因和膽固醇氧化酶基因等[6]。盡管這些基因顯著提高了作物的抗蟲效果，但也會導(dǎo)致作物某些物質(zhì)組分或含量發(fā)生非預(yù)期效應(yīng)，并通過食物鏈的結(jié)構(gòu)和信息聯(lián)系對天敵昆蟲的亞群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。單寧是植物在系統(tǒng)發(fā)育過程中形成的一種天然的、對生態(tài)環(huán)境安全且能起到自我保護(hù)作用的多酚類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于雙子葉植物細(xì)胞壁或莖、葉、花和種子的液泡中[8]。研究表明，單寧具有抵御蟲害的作用，其抗蟲機(jī)理是能與昆蟲體內(nèi)的消化酶結(jié)合成復(fù)合體，沉淀蛋白質(zhì)，抑制酶活性，從而降低昆蟲對食物中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用，抑制昆蟲發(fā)育[9]。單寧根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)特性不同可以分為水解單寧(hydrolyable tannin, HT)和縮合單寧(condensed tannins, CTs)[10]，其中縮合單寧的含量與植物抗蟲性密切相關(guān)[11]。縮合單寧生物合成途徑主要包括公共苯丙烷代謝途徑、類黃酮-花青素代謝途徑和縮合單寧特異代謝途徑，其中縮合單寧特異代謝途徑?jīng)Q定縮合單寧的積累[12]?；ㄇ嗨剡€原酶(anthocyanin reductase, ANR)是該途徑的關(guān)鍵酶，其由BANYULS(BAN)編碼，它可將花青素立即催化合成2,3-順式-黃酮-3-醇，之后將2,3-順式-黃酮-3-醇進(jìn)一步聚合為縮合單寧[13]。目前，已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[14]、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)[15]、百脈根(Lotuscorniculatus)[16]和葡萄(Vitisvinifera)[17]等植物中成功克隆并證實BAN基因的功能。研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿BAN基因在莢果中表達(dá)量較高，導(dǎo)致紫花苜蓿縮合單寧主要積累在種皮中，而在植株中的含量較低，這也說明苜蓿體內(nèi)存在縮合單寧合成途徑，但植株中控制縮合單寧合成的BAN基因可能為隱性基因[18]，而通過常規(guī)育種獲得隱性純合體的概率較低，所以目前還沒有選育出植株中含有縮合單寧的紫花苜蓿新品種[8]。因此，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將花青素還原酶基因?qū)胱匣ㄜ俎ｓw內(nèi)，有望增加苜蓿葉片中縮合單寧含量，提高抗蟲性。

雜草對紫花苜蓿整個生育期的危害也是造成苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)下降的重要因素[19]。隨著苜蓿種植面積的不斷擴(kuò)大，人工和機(jī)械除草方式已無法快速達(dá)到除草效果，化學(xué)除草已成為目前消除苜蓿田雜草的主要方式。bar基因具有廣譜性除草劑草銨膦抗性，通過基因工程手段已將bar基因?qū)胄←?Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和馬鈴薯(Solanumtuberosum)等20多種作物中，并獲得了相應(yīng)的抗除草劑種質(zhì)[20]。因此，將bar基因?qū)胱匣ㄜ俎ｓw內(nèi)并配合相應(yīng)的除草劑，能有效去除雜草，大大減少勞動力，提高苜蓿產(chǎn)量。

本研究在課題組前期從甘肅紅豆草(Onobrychisviciaefolia. cv. Gansu.)中克隆并構(gòu)建的OvBAN/bar雙價基因及獲得的轉(zhuǎn)紫花苜蓿植株基礎(chǔ)上，探索了其對苜蓿蚜蟲的抗性，同時進(jìn)行了除草劑抗性試驗，以期篩選獲得抗蟲性強(qiáng)并具除草劑抗性的紫花苜蓿種質(zhì)資源，并為抗蟲轉(zhuǎn)基因的研究提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試轉(zhuǎn)基因株系及受體“甘農(nóng)3號”紫花苜蓿(M.sativa. cv. Gannong No.3)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供，轉(zhuǎn)基因材料利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得[21]，OvBAN基因雙標(biāo)記[綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)記基因和抗除草劑bar基因]表達(dá)載體由課題組陳春艷[22]從甘肅紅豆草中克隆并構(gòu)建。本試驗于2018年6-10月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室及溫室中進(jìn)行。

1.2 分子生物學(xué)鑒定

以含OvBAN的質(zhì)粒為陽性對照，野生型紫花苜蓿為陰性對照，ddH2O為空白對照，提取的卡那霉素抗性植株基因組DNA為模板，以O(shè)vBAN的特異性引物(OvBAN-F1: 5′-CGCCCGGGATGGCCACCAATACGAAGCAATC-3′ 和OvBAN-R1: 5′-GCGAGCTCTTAGTTCTTCAGGGCCCCCTTAGTC-3′)進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物長度為1020 bp。

為了鑒定OvBAN基因是否整合并遺傳到苜蓿以及在苜蓿中的拷貝數(shù)，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern blot檢測。用EcoRⅠ過夜酶切基因組DNA，以地高辛隨機(jī)標(biāo)記的OvBAN基因全長作為探針，參照羅氏地高辛說明書(DIG DNA Labeling and Detection Kit, Roche)，進(jìn)行探針制備、轉(zhuǎn)膜及固定、分子雜交和免疫檢測。

1.3 OvBAN在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)分析

1.3.1實時熒光定量(quantitative RT-PCR, qRT-PCR)分析 用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取各轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株葉片總RNA，采用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Solarbio)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用LightCycler 96實時熒光定量PCR儀(Roche, 德國)進(jìn)行實時熒光定量分析，試驗設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL，按照SYBR Select Master Mix (TaKaRa)反應(yīng)說明，以紫花苜蓿甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GAPDH-F:5′-GTGGTGCCAAGAAGGTTGTTAT-3′和GAPDH-R:5′-CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG-3′)為內(nèi)參，用特異性引物(qRT-OvBAN-F2:5′-CGGTCCTTCTCTCACTCCAG-3′和qRT-OvBAN-R2:5′-ATGGATATCGAACCGGACAA-3′)對OvBAN基因進(jìn)行特異擴(kuò)增。采用兩步法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃酶激活5 min, 然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法[23]計算轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿相對于野生型紫花苜蓿OvBAN基因的相對表達(dá)量。

1.3.2花青素還原酶活性測定 粗酶液的提取：稱取紫花苜蓿葉片0.5 g放入研缽中，加入液氮研磨組織破碎后加入2 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH 7.4)和2%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP)充分研磨，然后轉(zhuǎn)入離心管中，用2 mL緩沖液充分清洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃下12000 r·min-1離心15 min，所得上清液即為粗酶提取液。取60 μL上清液，依次加入40 μL 20 mmol·L-1的抗壞血酸、50 μL 1.875 mmol·L-1的氯化氰定、1.315 mL 0.1 mmol·L-1的磷酸緩沖液(pH 7.4)，最后加入75 μL 20 mmol·L-1NADPH啟動反應(yīng)，在340 nm處檢測吸光度值的變化，對照為不含酶液的反應(yīng)體系[24]。以每μg蛋白在1 min內(nèi)酶反應(yīng)體系與對照的吸光度下降的差值為一個花青素還原酶活單位(ΔOD·min-1·μg-1protein)。

1.3.3縮合單寧含量測定 采用正丁醇-鹽酸法測定[25]。稱取紫花苜蓿葉片0.5 g放入研缽中，加入液氮研磨組織破碎后加入3 mL含0.5%冰乙酸的70%丙酮，5000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，沉淀用含0.5%冰乙酸的70%丙酮沖洗3次，合并上清液并定容至10 mL；取上清液2 mL，加入等體積的蒸餾水和三氯甲烷，震蕩搖勻后5000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，去除葉綠素，上清液既為縮合單寧提取液；取縮合單寧提取液1 mL，加入6 mL 95%的正丁醇-鹽酸(V∶V, 95∶5)，95 ℃下熱解1 h，冷卻后在555和600 nm處檢測吸光度值；以矢車菊素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株抗蟲性分析

從甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實訓(xùn)基地苜蓿田中采集到蚜蟲，經(jīng)鑒定為苜蓿蚜(Aphiscraccivora)，在溫度為(26±1)℃，時長為白天18 h/夜晚6 h，相對濕度為50%～60%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，選取1～2齡若蟲作為待接蚜蟲。選取OvBAN基因相對表達(dá)量較高的3株轉(zhuǎn)基因苜蓿(L3、L5、L6)以及野生型苜蓿3株(WT3、WT5、WT6)，將其相互對應(yīng)分為3組，每組分別放置在獨立的人工培養(yǎng)箱中。將待接蚜蟲饑餓處理2 h后，接種到苜蓿植株頂部的嫩芽中，每株接種10只1～2齡若蟲，接種后每2 d調(diào)查各植株上的蚜蟲數(shù)量，連續(xù)調(diào)查7次。采用蚜量比值法[26]對各植株進(jìn)行抗蚜性鑒定，根據(jù)蚜量比值的不同，可將抗蚜性分為5級，高抗(high resistance, HR)：0～0.25；抗(resistance, R)：0.26～0.50；中抗(medium resistance, MR)：0.51～0.75；感(susceptible, S)：0.76～1.25；高感(high susceptible, HS)：1.25以上；蚜蟲抑制率鑒定參照Deng等[27]的方法；具體公式如下：

蚜量比值=該材料第14天的蚜量/全部材料第14天的平均蚜量

蚜蟲抑制率=[(野生型植株蚜蟲數(shù)-轉(zhuǎn)基因植株蚜蟲數(shù))/野生型植株蚜蟲數(shù)]×100%

1.5 轉(zhuǎn)基因植株對除草劑的耐受性分析

將市售10%的草銨膦除草劑用蒸餾水稀釋至0.5%，用噴壺對轉(zhuǎn)基因苜蓿和野生型苜蓿進(jìn)行噴施，以所有葉片均噴施到草銨膦溶液并且液體自然滴落為止，10 d后觀察各株生長狀況。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較；采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行繪圖與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因苜蓿的分子生物學(xué)鑒定

2.1.1轉(zhuǎn)基因苜蓿的PCR檢測 通過遺傳轉(zhuǎn)化初步篩選獲得苜蓿轉(zhuǎn)化植株9株，為了驗證目的基因是否整合到“甘農(nóng)3號”紫花苜蓿的基因組中，利用OvBAN基因的特異性引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示陽性對照和4株轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增出約1020 bp的片段(圖1)。初步表明，OvBAN基因已經(jīng)整合到L3、L4、L5和L6植株的基因組中，PCR陽性率為44.44%。

圖1 轉(zhuǎn)基因苜蓿OvBAN基因的PCR檢測 Fig.1 PCR detection of alfalfa transformant M: Marker 2000；+: 質(zhì)粒DNA作為陽性對照；-: ddH2O為空白對照；WT: 野生型苜蓿DNA；L1～L9: 待檢測植株DNA。下同。M: 2.0-kb plus DNA ladder；+: Plasmid DNA as the positive control；-: ddH2O as the blank control；W: Wild-type plant；L1-L9: DNA from putative transgenic alfalfa lines. The same below.

2.1.2轉(zhuǎn)基因苜蓿的Southern blot檢測 為了進(jìn)一步驗證PCR擴(kuò)增結(jié)果的可靠性，利用OvBAN基因序列設(shè)計探針對4株P(guān)CR陽性植株進(jìn)行Southern blot檢測。檢測結(jié)果表明，4株P(guān)CR陽性植株均出現(xiàn)雜交信號，其中2個品系為單拷貝、1個品系為雙拷貝、1個品系為三拷貝，驗證了PCR結(jié)果的可靠性，將這4株陽性植株認(rèn)定為轉(zhuǎn)基因植株(圖2)。

2.1.3實時熒光定量(qRT-PCR)分析 qRT-PCR分析結(jié)果表明，OvBAN基因在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)能夠正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且OvBAN基因的相對表達(dá)量均顯著高于野生型植株，但不同轉(zhuǎn)基因植株間表達(dá)量存在差異(圖3)。

2.1.4花青素還原酶活性及縮合單寧含量分析 對轉(zhuǎn)基因植株的花青素還原酶活性進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株花青素還原酶活性與野生型植株相比均顯著提高(P<0.05)，其中L6轉(zhuǎn)基因植株花青素還原酶活性最高，較野生型植株提高了3.13倍(圖4)；而對各植株縮合單寧含量比較發(fā)現(xiàn)，L3、L5和L6轉(zhuǎn)基因植株縮合單寧含量均顯著高于野生型植株(P<0.05)，而L4轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖2 轉(zhuǎn)基因苜蓿的Southern blot檢測Fig.2 Southern blot analysis of transgenic plants M: Marker；+: 質(zhì)粒DNA作為陽性對照；L3～L6:擴(kuò)增為陽性的植株被消化的DNA。+: Plasmid DNA was used as the positive control；L3-L6: Digested DNA from transgenic lines.

圖3 轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片中OvBAN基因的qRT-PCR檢測Fig.3 qRT-PCR assays on OvBAN transcript in transgenic alfalfa leaves **表示轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量與野生型苜蓿有極顯著差異(P<0.01)；*表示轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量與野生型苜蓿有顯著差異(P<0.05)；t檢驗。** indicates extremely significant difference (P<0.01)；* indicates significant difference (P<0.05)；t test.

圖4 轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片中花青素還原酶活性及縮合單寧含量的分析Fig.4 Analysis of anthocyanin reductase activity and condensed tannins content of transgenic alfalfa leaves不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.

2.2 轉(zhuǎn)基因苜?？寡料x分析

圖5 轉(zhuǎn)基因與野生型苜蓿植株上蚜蟲數(shù)量的變化Fig.5 Changes in the number of aphids on transgenic and wild-type alfalfa

2.2.1轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型苜蓿上蚜蟲數(shù)量的變化 選取qRT-PCR檢測和花青素還原酶活性及縮合單寧含量測定中表達(dá)量較高的L3、L5和L6轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行人工接蟲后發(fā)現(xiàn)，野生型植株上蚜蟲數(shù)量均隨接種天數(shù)的增加而增加，而轉(zhuǎn)基因植株上蚜蟲數(shù)量均隨接種天數(shù)增加而增長緩慢，在第8天后，L5和L6轉(zhuǎn)基因植株上蚜蟲數(shù)量呈下降趨勢，而L3轉(zhuǎn)基因植株上蚜蟲數(shù)量在第10天時開始下降(圖5)。人工接蟲第21天后，野生型植株上的蚜蟲數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過轉(zhuǎn)基因植株上的蚜蟲數(shù)量(圖6)。

2.2.2轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型苜蓿抗蚜性鑒定 用蚜量比值法對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗蚜性鑒定，結(jié)果表明，L5和L6轉(zhuǎn)基因植株蚜量比值分別為0.21和0.11，抗蚜等級為高抗；L3轉(zhuǎn)基因植株蚜量比值為0.37，抗蚜等級為抗；而野生型植株蚜量比值均大于1.25，表現(xiàn)為高感蚜蟲(表1)。

圖6 轉(zhuǎn)基因與野生型苜蓿在人工接蟲21 d后蚜蟲的分布情況Fig.6 Distribution of aphids on transgenic and wild-type alfalfa after 21 days of artificial inoculation of aphids

植株P(guān)lant第14天的蚜蟲數(shù)量Number of aphids on day 14 (No.·plant-1)蚜量比值A(chǔ)phids volume ratio抗性等級Resistance level植株P(guān)lant第14天的蚜蟲數(shù)量Number of aphids on day 14 (No.·plant-1)蚜量比值A(chǔ)phids volume ratio抗性等級Resistance levelL3270.37抗 RWT31251.73高感 HSL5150.21高抗 HRWT51421.96高感 HSL680.11高抗 HRWT61171.62高感 HS

注：L3、L5、L6為轉(zhuǎn)基因株系；WT3、WT5、WT6為野生型株系。下同。

Note： L3, L5and L6are transgenic lines; WT3, WT5and WT6are wild type strains. The same below.

2.2.3轉(zhuǎn)基因苜蓿對蚜蟲的抑制率 L3、L5和L6轉(zhuǎn)基因植株在第14天時的蚜蟲抑制率分別為78.40%、89.44%和93.16%，與蚜量比值表明的抗蚜結(jié)果基本一致(表2)。

表2 轉(zhuǎn)基因苜蓿對蚜蟲的抑制率Table 2 Inhibition rate of transgenic alfalfa to aphids

圖7 轉(zhuǎn)基因苜蓿對除草劑的耐受性分析Fig.7 Herbicide tolerance analysis of transgenic alfalfa

2.3 轉(zhuǎn)基因苜蓿對除草劑的耐受性分析

用0.5%的市售草銨膦溶液噴施各株系，10 d后野生型植株葉片萎蔫，莖稈枯黃，最終全部死亡；而轉(zhuǎn)基因植株除個別葉片枯黃脫落外，絕大多數(shù)葉片和莖稈長勢良好，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象(圖7)。表明抗除草劑bar基因已整合到苜?；蚪M中，并穩(wěn)定表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

蟲害是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源殺蟲基因?qū)朕r(nóng)作物中，使作物獲得抗蟲性已成為基因工程研究的重要內(nèi)容。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)大，生態(tài)安全問題已受到越來越多的關(guān)注，而轉(zhuǎn)基因作物對非靶標(biāo)昆蟲的影響就是關(guān)注的焦點之一[28]。有研究報道，植物凝集素基因(如GNA,ACA基因)在水稻、小麥和馬鈴薯等作物中表達(dá)可以強(qiáng)烈抑制蚜蟲的生長發(fā)育[28-30]，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，某些凝集素會影響非靶標(biāo)昆蟲及哺乳動物腸胃中的抑制酶降解，產(chǎn)生毒害作用[31]。也有研究報道，轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)基因的作物其花粉飄落到家蠶或蝶類昆蟲的寄主植物上，也可能會對它們的生長發(fā)育造成一定影響[31]。植物中存在著相當(dāng)豐富的天然抗蟲活性物質(zhì)，其中如單寧類化合物、萜烯類化合物以及黃酮類化合物等次生代謝物質(zhì)對植物抗蟲性有重要的作用[32-33]。次生代謝物質(zhì)是植物代謝的終端產(chǎn)物，通過降解或合成產(chǎn)生，不會再次對代謝過程起作用，因此植物次生代謝物質(zhì)在植物抗蟲性的研究中具有重要的生態(tài)學(xué)意義。武予清等[32]研究發(fā)現(xiàn)棉花(Gossypiumspp.)葉片單寧-黃酮類化合物對棉鈴蟲生長發(fā)育有顯著抑制作用，其中縮合單寧、蕓香苷的抑制作用較強(qiáng)。陳巨蓮等[33]研究表明次生代謝物對麥蚜的行為存在影響，認(rèn)為單寧、丁布和香豆素等次生代謝物與小麥的抗蚜性密切相關(guān)。

植物單寧一般被認(rèn)為是有效的化學(xué)防御物質(zhì)，能與昆蟲中腸中的蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成穩(wěn)定的交叉鏈，抑制酶活性，影響中腸對蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分的吸收與利用，單寧還可以與淀粉形成絡(luò)合物而影響昆蟲對淀粉的消化吸收[34]。林鳳敏等[35]研究了不同棉花品種(系)的主要次生代謝產(chǎn)物與其對綠盲蝽(Lyguslucorum)的抗性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)苗期頂葉中的縮合單寧含量與棉花對綠盲蝽的抗性存在顯著正相關(guān)，縮合單寧含量較高的棉花品種(系)可以減輕或抑制綠盲蝽的危害程度。沈法富等[36]將單寧含量較高的羅布麻(Apocynumvenetum)DNA導(dǎo)入棉花子房，選育出兼抗棉鈴蟲和棉蚜的棉花種質(zhì)，檢測表明抗蟲種質(zhì)單寧含量較野生型棉花增加了136.70%，顯著抑制了初孵棉鈴蟲的生長和發(fā)育。但也有學(xué)者認(rèn)為單寧與抗蟲性無關(guān)，如莫建初等[37]研究發(fā)現(xiàn)單寧類物質(zhì)對油桐尺蠖(Buzurasuppressaria)的生長發(fā)育無顯著影響；武德功等[38]通過對4種不同抗蚜性紫花苜蓿品種受豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)脅迫后單寧含量的動態(tài)變化研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲品種的單寧含量在整個危害脅迫過程中與感蟲品種差異不顯著，表明單寧含量與苜蓿的抗蟲性不相關(guān)。而本試驗中對縮合單寧含量較高的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行人工接蟲后發(fā)現(xiàn)，野生型植株上蚜蟲數(shù)量均隨接種天數(shù)的增加而不斷增加，而轉(zhuǎn)基因植株上蚜蟲數(shù)量均隨接種天數(shù)增加而增長緩慢并在后期呈下降趨勢，說明苜蓿縮合單寧的增加對蚜蟲產(chǎn)生了拒食或忌避作用，這與武德功等[38]的研究結(jié)果不一致，原因可能是因為紫花苜蓿葉片中單寧類物質(zhì)含量較少，不同品種苜蓿的單寧含量差異不明顯并且沒有達(dá)到抵御蟲害的含量范圍，而過表達(dá)的OvBAN基因顯著提高了苜蓿的單寧含量，使單寧成為與抗蟲性相關(guān)的主要因素。

利用基因工程手段將抗蟲次級代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因?qū)胫参镏?，可能會獲得環(huán)境友好的抗蟲植物，為抗蟲轉(zhuǎn)基因研究注入新的活力。然而由于植物次生代謝產(chǎn)物受多基因控制，目前對于其在植物抗蟲育種中的研究和應(yīng)用較少。但是在深入研究這些次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)催化酶和主控基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行定位和克隆抗性基因，并利于轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其運用于抗蟲育種中的潛力巨大，這也對于未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有特別重要的意義。目前，植物類黃酮和萜類代謝產(chǎn)物相關(guān)基因和抗蟲性關(guān)系的研究也已有報道[39-40]。本研究以培育抗臌脹病苜蓿新品種為初衷，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙價基因OvBAN/bar導(dǎo)入紫花苜蓿體內(nèi)，通過對抗性苗進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，得到3株表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因植株。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)OvBAN/bar基因苜蓿的抗蟲現(xiàn)象，因此對植株進(jìn)行人工接蟲處理。通過對蚜蟲數(shù)量變化進(jìn)行研究表明，轉(zhuǎn)OvBAN/bar基因可以提高紫花苜蓿的抗蟲性，驗證了其具有抗蟲效果，這也為培育抗蟲轉(zhuǎn)基因苜蓿新品種提供了新基因、新方法和新思路。