薛曉暢，成俊宏，郭紅彬，王東方，張喜燁，袁曉峰，李志蘭，王增祿，3

1西安交通大學(xué)//三八婦樂集團生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，陜西 西安 710065；2西安藍(lán)綠卓生物科技有限公司，陜西西安 710000；3空軍（第四）軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室，陜西 西安 710032

七葉皂苷是由七葉樹科植物七葉樹的果實娑羅子中提取得到的總皂苷、β-七葉皂苷和異七葉皂苷等的總稱[1]，主要含有七葉皂苷A、B、C和D 4種組份[2-3]。大量研究表明，七葉皂苷及其鈉鹽已在臨床廣泛用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹、靜脈回流障礙或燒傷等多種疾病的治療[4-5]。宮頸管表層的單層柱狀上皮本身抵抗感染的能力比較差，在受到各種機械性刺激時容易受損繼而引發(fā)感染，導(dǎo)致急慢性宮頸炎[6-7]。過度清潔陰道導(dǎo)致的菌群失衡也會誘發(fā)宮頸炎[8-9]。急性宮頸炎主要表現(xiàn)為宮頸紅腫、頸管黏膜水腫、常伴急性陰道炎或子宮內(nèi)膜炎，慢性宮頸炎有宮頸糜爛（宮頸柱狀上皮異位）、宮頸肥大、宮頸息肉、宮頸腺囊腫和宮頸外翻等多種表現(xiàn)[10-11]。急性宮頸炎治療不及時會發(fā)展為慢性宮頸炎，其誘發(fā)的損傷會導(dǎo)致乳頭瘤狀病毒的感染病增加罹患宮頸癌的風(fēng)險[12]。還有研究報道，宮頸炎可加劇HIV的傳播，治療宮頸炎后，艾滋病患者宮頸中的HIV病毒的RNA拷貝數(shù)顯著降低[13]。因此，研發(fā)宮頸炎治療藥物具有重要的臨床價值。

雖然關(guān)于七葉皂苷用于抑制炎癥的研究有大量報道[14-17]，目前關(guān)于七葉皂苷用于宮頸炎治療的研究國內(nèi)外還鮮有涉及。研究者此前結(jié)合利用醇提和軟性填料Q-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析獲得了七葉皂苷提取的新工藝，分離純化的總七葉皂苷純度達(dá)到90%以上，該產(chǎn)物制備成氣霧劑/噴霧劑用于組織水腫模型大鼠的治療，發(fā)現(xiàn)對于組織水腫有顯著的療效[18]。本研究將七葉皂苷制備成凝膠劑并應(yīng)用于宮頸炎大鼠模型的治療，結(jié)果表明該凝膠劑對模型大鼠具有明顯的治療效果，可以顯著改善大鼠外陰紅腫炎癥、減輕組織水腫程度、減少陰道分泌物；HE染色結(jié)果表明損傷部位的炎性細(xì)胞浸潤水平被顯著抑制；表明使用該工藝制備的七葉皂苷有望用于宮頸炎的治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠120只（重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司），SPF級，體質(zhì)量200 ± 20 g。

1.2 主要試劑和儀器

苯酚和阿拉伯樹膠（Sigma），七葉皂苷（藍(lán)綠卓生物科技有限公司制備），凝膠劑（陜西三八婦樂特醫(yī)食品有限公司制備），卡波姆940（路博潤公司），丁二醇（大賽璐公司），羥苯甲酯（晉盛大公化工有限公司），檸檬酸（濰坊英軒實業(yè)有限公司），L-精氨酸（協(xié)和發(fā)酵麒麟（中國）制藥公司）。其他常規(guī)化學(xué)試劑購自西安紅巖試劑廠。

1.3 方法

1.3.1 七葉皂苷凝膠劑制備 七葉皂苷按照此前方法進(jìn)行制備和純度鑒定[18]。然后按照下表的配方制備七葉皂苷凝膠劑（表1）。

表1 七葉皂苷凝膠劑配方

1.3.2 建立大鼠宮頸炎模型、實驗分組 所有SD大白鼠予以標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機分為4組：正常組、模型組、七葉皂苷鈉凝膠劑高（2.5 mg/g）、低（0.5 mg/g）劑量組。取苯酚15.0 g、阿拉伯樹膠20.0 g制成25%苯酚膠漿，利用此膠漿在SD大鼠中制備宮頸炎模型。具體方法為：首先用戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，然后采用大鼠固定筒架將大鼠倒立固定好，將12號注射針頭尖端剪去，磨平，使頭部光滑，用處理過的注射針頭輕輕插入大鼠陰道深處約2 cm處，注入25%苯酚膠漿0.25 mL，棉球固定陰道口，保持大鼠倒立狀態(tài)5 min，給苯酚膠漿，2 d/次，共5次。造模過程中觀察陰道變化，給予苯酚膠漿5次后大部分大鼠陰道口紅腫，有膿性物流出。結(jié)果表明，出模率為100%且操作治療過程中無動物死亡。

1.3.3 大鼠宮頸炎模型的治療 造模成功隔日后，正常組和模型組大鼠給予正常飼養(yǎng)，治療組將SD大鼠裝入固定筒架，頭部朝下，用處理過的注射針頭輕輕插入大鼠陰道深處約2 cm處給予高劑量（2.5 mg/g）和低價量（0.5 mg/g）七葉皂苷鈉凝膠劑0.25 mL進(jìn)行治療，不含七葉皂苷的凝膠基礎(chǔ)方作為陰性對照。每日給藥1次，并稱量大鼠體質(zhì)量并計算相對體質(zhì)量變化（實驗前后體質(zhì)量變化情況）、陰道口紅腫情況以及膿性分泌物流出量等。其中陰道口紅腫評分標(biāo)準(zhǔn)：無（0分）、輕度（1分）、中度（2分）和重度（3分）；陰道口膿性分泌物評分標(biāo)準(zhǔn)：無（0分）、少量（1分）、中量（2分）和多量（3分）。給藥10次后，迅速麻醉處死大鼠，進(jìn)行取材觀察。

1.3.4 組織取材、處理和切片染色 選取大鼠陰道至子宮分角處部分組織進(jìn)行稱重，考慮到大鼠個體間體質(zhì)量差異的影響，計算組織相對重量（組織/體質(zhì)量×200）衡量組織水腫情況。然后將取材組織在4%多聚甲醛中固定24 h，送西安交通大學(xué)附屬一醫(yī)院病理科進(jìn)行常規(guī)的梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（片厚5 μm），并進(jìn)行HE染色和結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用雙尾t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苯酚膠漿可誘導(dǎo)大鼠宮頸炎模型

前期我們利用不同濃度的苯酚膠漿在SD大鼠中誘導(dǎo)宮頸炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%以下的苯酚膠漿出模率不高且大鼠癥狀不穩(wěn)定，而25%苯酚膠漿則能夠高效率地誘導(dǎo)出宮頸炎模型。經(jīng)苯酚膠漿處理5次后，大鼠的陰道嚴(yán)重水腫且有膿性分泌物流出（圖1）；解剖其陰道至宮頸段，發(fā)現(xiàn)組織明顯紅腫、質(zhì)量顯著增加（圖2）。

圖1 苯酚膠漿誘導(dǎo)宮頸炎模型大鼠陰道外觀

圖2 苯酚膠漿誘導(dǎo)宮頸炎模型陰道至宮頸組織形態(tài)變化

2.2 七葉皂苷凝膠對大鼠宮頸炎模型的治療作用

將制備的七葉皂苷鈉凝膠劑用于對大鼠宮頸炎模型進(jìn)行了治療，結(jié)果表明七葉皂苷鈉凝膠劑在低劑量時即對模型大鼠具有一定的療效，而高劑量組效果顯著。與實驗開始前體質(zhì)量相比，模型組大鼠較正常組體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.001，圖3），而七葉皂苷鈉高、低劑量治療組均有明顯改善（P＜0.001），與正常組相比無顯著的體質(zhì)量減輕，基礎(chǔ)方治療組體質(zhì)量減輕略微緩解（P＜0.05）；通過稱重并計算相對重量考察陰道至子宮部位的組織水腫情況，發(fā)現(xiàn)模型組重量增加（P=0.020），而七葉皂苷鈉治療組則與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其中高劑量組改善顯著（P=0.016，圖4）；對大鼠的陰道紅腫和分泌物量進(jìn)行評分，結(jié)果表明七葉皂苷鈉可以顯著逆轉(zhuǎn)模型組出現(xiàn)的陰道紅腫且分泌物明顯減少，顏色也由模型組的淡黃色轉(zhuǎn)為無色（圖5）。

圖3 七葉皂苷鈉凝膠劑有效善宮頸炎模型大鼠的體質(zhì)量減輕

圖4 七葉皂苷鈉凝膠劑明顯減輕宮頸炎大鼠的組織水腫

為了進(jìn)一步明確七葉皂苷鈉的抑炎效果，給藥10次后處死大鼠，取陰道至子宮部位組織進(jìn)行多聚甲醛固定，石蠟包埋并組織切片。正常大鼠光鏡下可見宮頸黏膜表被復(fù)層扁平上皮，根據(jù)周圍不同，表面有或無角化，或有數(shù)層粘液樣細(xì)胞，上皮下為致密結(jié)締組織，可見少量小血管；陰道組織光鏡下組織結(jié)構(gòu)與宮頸基本相同，與性周期有關(guān)的形態(tài)學(xué)改變不明顯（圖6A）。模型組大鼠宮頸組織表現(xiàn)為粘膜下充血和大量炎性細(xì)胞浸潤，伴隨上皮細(xì)胞變性、壞死，上皮內(nèi)亦有炎性細(xì)胞浸潤；陰道組織主要表現(xiàn)為粘膜下充血和炎細(xì)胞浸潤，上皮下有大量中性粒細(xì)胞浸潤（圖6B）?；A(chǔ)方治療組大鼠組織形態(tài)改善不明顯（圖6C）。而七葉皂苷鈉凝膠劑治療組組織局部僅可見少量的炎性細(xì)胞浸潤，無上皮變性和壞死（圖6D、E）。

圖5 七葉皂苷鈉凝膠劑可有效緩解宮頸炎大鼠陰道紅腫和膿性分泌物

圖6 七葉皂苷鈉凝膠劑可有效緩解宮頸炎大鼠陰道紅腫和膿性分泌物

3 討論

研究表明七葉皂苷具有抗組織水腫、抗?jié)B出、改善血液循環(huán)和預(yù)防組織內(nèi)水分存積等作用[14,17-18]，被廣泛應(yīng)用于臨床治療腦水腫或創(chuàng)傷性水腫、靜脈回流障礙、痔瘡或燒傷等疾病[4-5,19]。此外，七葉皂苷還具有顯著的消炎作用[20]，如實驗表明七葉皂苷對血栓性靜脈炎、腦炎、關(guān)節(jié)炎等具有良好的治療作用[21-22]，甚至有報道其抑炎效果可達(dá)氫化可的松的4～5倍。有文獻(xiàn)報道七葉皂苷堿金屬鹽或氨基酸鹽可用于治療肺部急性炎癥和水腫，且與傳統(tǒng)消炎藥物相比具有不抑制機體的免疫功能的優(yōu)勢。七葉皂苷還可聯(lián)合關(guān)節(jié)滑膜切除術(shù)用于厚皮性骨膜病的治療[23]。由于大部分臨床炎癥常常伴隨明顯的組織水腫[24]，因此七葉皂苷在消炎和抗組織水腫中的雙重作用日益受到重視。

我們前期改良了傳統(tǒng)七葉皂苷提取工藝，獲得了簡便（節(jié)省幾十小時）、經(jīng)濟（使用水提或低濃度醇提代替高濃度醇提）和環(huán)保（去除了氯仿、乙醚等處理步驟）的七葉皂苷提取工藝。獲得的產(chǎn)品制備成噴霧劑對大鼠組織水腫具有良好的治療效果。雖然關(guān)于七葉皂苷用于消炎的研究有大量文獻(xiàn)[14-17]，但是對于七葉皂苷用于宮頸炎治療的研究鮮有報道?？紤]到宮頸炎在成年女性中發(fā)病率極高且急性宮頸炎治療不及時會發(fā)展為慢性宮頸炎，增加罹患宮頸癌和加劇HIV傳播的風(fēng)險[12]。因此，研發(fā)宮頸炎治療藥物具有重要的臨床價值。目前宮頸炎的治療為全身給予抗生素治療，副作用大且容易誘發(fā)耐藥菌出現(xiàn)。本研究中探索性地考察了七葉皂苷凝膠劑局部給藥用于宮頸炎治療的可行性。我們利用25%的苯酚膠漿通陰道局部給藥高效率地誘導(dǎo)了宮頸炎模型，當(dāng)給予七葉皂苷進(jìn)行干預(yù)治療時，發(fā)現(xiàn)七葉皂苷在2.5 mg/g凝膠的濃度下對宮頸炎具有顯著的療效，其明顯減輕了模型大鼠的陰道紅腫、減少了分泌物；陰道及宮頸組織水腫明顯改善，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)七葉皂苷治療組大鼠宮頸組織中的炎性細(xì)胞浸潤被顯著抑制，無上皮細(xì)胞變性和壞死，血管充血情況也有明顯的改善。

總之，七葉皂苷凝膠劑對宮頸炎模型大鼠具有良好的治療作用，有望成為一種成本較小、使用方便、功能優(yōu)異的宮頸炎治療藥物。