劉日清，黃仁林，梁 柱

1廉江市人民醫(yī)院心胸外科，廣東 廉江 524400；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，廣東 湛江 524021

非小細(xì)胞型肺癌（NSCLC）只有約20%可以早期切除，然而在接受手術(shù)的患者中，大約50%復(fù)發(fā)，主要復(fù)發(fā)原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。NSCLC預(yù)后的主要影響因素是腫瘤的臨床分期，但是既往研究發(fā)現(xiàn)，具有相同臨床分期和其他臨床特征的患者的預(yù)后存在顯著差異，而通過將分子生物標(biāo)志物的評估與傳統(tǒng)癌癥分期相結(jié)合可以改善NSCLC的管理[2]，miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的翻譯并影響一系列細(xì)胞功能如增殖、分化和凋亡。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織中miRNA表達(dá)發(fā)生明顯改變，且與預(yù)后和治療結(jié)果相關(guān)，miRNA能夠提供比單獨(dú)的單個(gè)標(biāo)記物或基因表達(dá)譜的表達(dá)更準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測[2-3]。miRNA-31作為目前臨床研究較少的一種微小RNA分子，在部分臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)作為一種致癌基因參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，且通過針對特定腫瘤抑制因子進(jìn)行抑制[4-5]。有研究在192例原發(fā)性結(jié)直腸癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)miR-31過表達(dá)可能參與原發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)展和進(jìn)展[6]。但截至目前，臨床關(guān)于miRNA-31在NSCLC中的研究仍十分匱乏，且臨床研究稀少。本研究關(guān)注于血清中miR-31的表達(dá)與NSCLC的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)血清miR-31作為NSCLC新的分子標(biāo)志物的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇我院及廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月～2019年1月NSCLC患者42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者都經(jīng)由病理確診，符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)提出的《非小細(xì)胞肺癌指南》中的診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)；術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等治療措施；術(shù)前血常規(guī)、肝腎功能正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肺部疾病如間質(zhì)性肺炎；妊娠期或哺乳期患者。獲得上述患者的肺癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本，并抽取該42例患者和40例對照健康人群的外周血。42名患者年齡68.5±4.6歲，男性24名，女性18名；36例患者有吸煙史，6例不吸煙；其中I期18例，II期15例，III期9例。本次研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批后實(shí)施。

1.2 標(biāo)本處理

規(guī)范收集新鮮切除手術(shù)標(biāo)本，在離體后迅速放入凍存管，存入-80 ℃保存。術(shù)前1 d抽取外周血3～5 mL后置于EDTA抗凝管中，靜置30 min，4 ℃下1500 r/min離心20 min，取上層清亮血清至RNAse-free EP管中，置于-80 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)流程

1.3.1 總RNA的提取 肺癌組織和癌旁組織采取TRIzol試劑（Invitrogen公司）一步提取法，具體操作按照說明書進(jìn)行。使用分光光度計(jì)測量RNA濃度和純度，取1 μg總RNA，100 V電壓下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30 min，觀察RNA完整性。提取的總RNA分裝在EP管中，-80 ℃下保存。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行（試劑由銳博生物生產(chǎn)）。反應(yīng)體系共15 μL（在7 μL逆轉(zhuǎn)錄混合液體系中加入5 μLRNA和3 μL逆轉(zhuǎn)錄引物）。反應(yīng)條件為42 ℃轉(zhuǎn)60 min，75 ℃i10 min。

1.3.3 RT-PCR 采用TaqMan探針法，按照試劑盒說明書操作（北京晶典生物）。反應(yīng)體系包括cDNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL， Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，10×SYBER Green 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃反10 min，95 ℃i15 μL，60 ℃560 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

miRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算，所有數(shù)據(jù)利用SPSS19.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析，ROC曲線分析miR-31對NSCLC的診斷效能。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測miR-31的結(jié)果

miR-31的擴(kuò)增曲線呈S型，曲線平滑，溶解曲線為單峰，無雜峰信號，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和污染（圖1）。

圖1 miR-31的PCR結(jié)果

2.2 miR-31在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

miRNA在NSCLC組織中表達(dá)水平的2-△△Ct值為5.46±4.19，在相應(yīng)癌旁組織中為3.79±7.08。肺癌組織miR-31表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。

2.3 miR-31表達(dá)與NSCLC臨床特征的相關(guān)性

單因素分析結(jié)果表明，miR-31在NSCLC組織中的表達(dá)水平與臨床分期，是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、病理類型、病理分級無關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是miR-31 表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表1、2）。

2.4 miR-31

在血清中的表達(dá)及組織和血清miR-31表達(dá)量的相關(guān)性miR-31在NSCLC患者中的血清表達(dá)水平為3.13±1.94，在正常人中的血清表達(dá)水平為1.23±2.28，NSCLC患者血清miR-31表達(dá)水平高于正常人（t=4.07，P=0.0001）?；颊叻伟┙M織和血清中的miR-31的水平呈正相關(guān)（r=0.909，P=0.001，圖2）。

表1 NSCLC組織中miR-31表達(dá)與臨床特征的單因素分析（Mean±SD）

表2 NSCLC組織中miR-31表達(dá)與臨床特征的多因素分析

圖2 組織miR-31和血清miR-31表達(dá)水平的相關(guān)性

2.5 血清miR-31水平對NSCLC的診斷效能

圖3 miR-31與NSCLC的ROC曲線

通過ROC曲線得知，當(dāng)曲線下面積最大時(shí)，面積為0.803，此時(shí)敏感性為0.829，特異性為0.763（圖3）。

3 討論

microRNAs已被確立為在肺癌發(fā)展，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和治療反應(yīng)等過程中具有相關(guān)作用的參與者[7-8]。在切除的腫瘤樣本或細(xì)針抽吸樣本中測量的miRNA已成為腫瘤診斷，預(yù)后和治療反應(yīng)預(yù)測的引人注目的生物標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈円子跈z測并且極端特異性[9]。痰、血漿、血清或全血中存在的miRNA越來越多地被探索為用于早期檢測癌癥的侵入性較小的生物標(biāo)志物[10-12]。miRNA31是一種進(jìn)化上保守的miRNA[13]，位于人類染色體9q21.3上，并與CDKN2和IFNA家族的簇相鄰，是多種人類癌癥中基因組丟失的熱點(diǎn)[14]。目前，miR-31已被發(fā)現(xiàn)在包括乳腺癌[15]、肺癌[16-17]、結(jié)直腸癌[18]和成人T細(xì)胞白血病[14]等多種癌癥組織中表達(dá)異常。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織miR-31顯著高于癌旁組織，NSCLC患者血清miRNA水平顯著高于正常人血清，表明miR-31參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。有研究也同樣發(fā)現(xiàn)正常人體肺組織中miR-31中的3P、5P表達(dá)量均遠(yuǎn)低于肺腺癌組織中的miR-31中3P、5P表達(dá)量[19]，提示肺癌組織存在miR-31基因突變。有研究發(fā)現(xiàn)MET、PIK3C2A、GRB10等均為miR-31的直接靶基因[20]，miR-31一方面能通過抑制多種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程，包括靶向抑制大腸癌中RASAl基因和乳腺癌中RhoA基因的表達(dá)；另一方面，miR-31作為致癌因子能通過抑制某些腫瘤抑制因子LATS2和PPP2R2A來抑制特定肺癌細(xì)胞的功能。但是，某個(gè)特定microRNA在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)不一定會促進(jìn)癌癥的發(fā)生和擴(kuò)增，miR-31在NSCLC組織中的異常高表達(dá)可能是腫瘤表型的多種機(jī)制的綜合作用結(jié)果。研究結(jié)果顯示，NSCLC臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響miR-31表達(dá)水平的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素，miR-31診斷NSCLC的敏感性0.829，特異性0.763，表明miR-31參與NSCLC疾病的進(jìn)展，且針對NSCLC有較高的臨床診斷價(jià)值。

本項(xiàng)研究關(guān)注miR-31對NSCLC診斷的價(jià)值，希望能發(fā)現(xiàn)NSCLC新的分子標(biāo)志物，提高診斷的準(zhǔn)確性，為病人提供更精細(xì)化的疾病管理。研究發(fā)現(xiàn)miR-31在NSCLC中表達(dá)上升，血清miR-31可以作為較好的監(jiān)測指標(biāo)。但miR-31在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮什么樣的作用及其機(jī)制，仍需要更進(jìn)一步的研究加以論證。

[20]侯春英.MET-PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)miRNA--31調(diào)控肺腺癌腫瘤干細(xì)胞功能[D].北京： 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2016.