黃耀星，余丹純，孫小娟，江舒曼，李偉冬，賈 林

廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510180

胰腺癌是惡性程度最高的消化系腫瘤，發(fā)病率占我國惡性腫瘤第8位，5年生存率僅為7.2%[1]。轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主因[2]，發(fā)現(xiàn)和驗證與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因及分子機制對胰腺癌的診療有著重要意義。CD74是II型跨膜糖蛋白，可在多種癌前病變和惡性腫瘤組織中表達[3]。有文獻報道CD74與胰腺癌的預后及神經(jīng)侵襲密切相關(guān)，CD74在具高神經(jīng)侵襲轉(zhuǎn)移特性胰腺癌細胞Capan-2中高表達，降低CD74表達水平可抑制細胞的體外侵襲力[4-6]，而CD74在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制尚不清楚。Gil-Yarom等[7]在淋巴細胞研究中發(fā)現(xiàn)，CD74的胞內(nèi)段可能與RUNX1和RUNX3結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。目前已有報道證實RUNX3是胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子開關(guān)[8]，而胰腺癌細胞CD74內(nèi)源化后能否激活類似淋巴細胞的下游信號通路目前尚無研究報道。

為在活體胰腺癌細胞內(nèi)證實CD74與RUNX3之間的相互作用，本研究采用前期構(gòu)建的CD74-siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染Capan-2細胞，利用免疫共沉淀技術(shù)驗證CD74與RUNX3是否存在蛋白相互作用，為胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制提供更多的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌Capan-2細胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)）；慢病毒載體（Clonetech）、pSUPERretro-puro質(zhì)粒（Oligoengine）、Lipofectamin 2000（Invitrogen）；DH5α感受態(tài)細胞、293T細胞（廣州博川生物）；限制性內(nèi)切酶（NEB）；質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化）；10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；Trizol試劑盒、CD74、RUNX3引物（Invitrogen）、RT-PCR所需DNA聚合酶和Sybrgreen試劑（TaKaRa）；鼠抗人CD74和RUNX3（Abcam），羊抗鼠二抗、β-actin（Santa Cruz）；免疫共沉淀試劑盒Anti-HA Immunopreci-pitation Kit（IP 0010，Sigma）；BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒（上海博彩生物）；ECL化學發(fā)光試劑盒（北京普利萊）。

1.2 CD74-siRNA慢病毒載體構(gòu)建

采用課題組前期研究篩選的CD74-siRNA最佳抑制序列和慢病毒載體，酶切鑒定正確后包裝質(zhì)粒，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞，收獲并濃縮病毒上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹9]。

1.3 細胞培養(yǎng)和慢病毒感染

人胰腺癌Capan-2細胞在含10%胎牛血清、青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取狀態(tài)良好細胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿，待融合度達80%～90%時，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明操作。分為對照組（空白載體）和實驗組（CD74-siRNA），每組按1：1000濃度加入4 μg/mL的聚凝胺，12 h后更換正常培養(yǎng)液，第2天重復進行，共感染4次；感染結(jié)束后加入0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選陽性克隆3 d以上；每日更換培養(yǎng)液，觀察并去除死細胞，細胞長滿后凍存（P0代）并傳代，收集P2代細胞評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 實時熒光定量PCR

Trizol法提取兩組細胞的總RNA，測定RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，CD74、RUNX3、β-Actin等引物序列（表1）。擴增條件：95 ℃預變性30 s、95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。讀取Ct值，以 2-△△Ct值代表各組mRNA相對表達量。

表1 引物的序列

1.5 Western blot檢測

兩組細胞在冰上操作，RIPA裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白分為2份，一份用于Western blot，另一份用于免疫共沉淀。以總蛋白20 μg進 行 10%SDS-PAGE電 泳 ， 電 轉(zhuǎn) 膜 至 PVDF，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1：1000稀釋的鼠抗人CD74、RUNX3一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光法顯影拍照，β-actin為內(nèi)參。Image J軟件分析計算CD74、RUNX3和β-actin蛋白相對表達量。

1.6 正反向免疫共沉淀實驗

按照免疫共沉淀試劑盒說明書操作。Capan-2細胞經(jīng)RIPA裂解提取蛋白后，分為正向和反向免疫共沉淀組，各取裂解液分別加入1 μg的CD74抗體和RUNX3抗體，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜；將用緩沖液預處理過的10 μL HA瓊脂糖beads加入和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與HA瓊脂糖beads偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在4 ℃條件下以12 000 r/min速度離心30 s，將瓊脂糖beads離心至管底；小心吸去上清，瓊脂糖beads用1 mL裂解緩沖液洗3～4次；最后加入15～20 μL的1×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮5 min。上述樣品用10%的SDS-PAGE電泳，并進行Western blot分析（同實驗1.5步驟）。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對細胞CD74蛋白和mRNA表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，實驗組CD74蛋白相對表達量為0.09±0.01，對照組CD74蛋白相對表達量為2.78±0.04，實驗組CD74蛋白表達量較對照組顯著下降（P＜0.05，圖1）；qRT-PCR結(jié)果顯示，實驗組與對照組CD74 mRNA的2-△△Ct值分別為0.39±0.001、1.00±0.00，CD74-siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染可抑制CD74 mRNA的表達（P＜0.05，圖2）。

圖1 兩組細胞CD74和RUNX3蛋白表達差異

圖2 兩組細胞CD74 mRNA表達差異

2.2 抑制CD74對細胞RUNX3蛋白和mRNA表達的影響

實驗組與對照組的RUNX3相對蛋白表達量為0.006±0.0004、1.24±0.09（圖1）；qRT-PCR結(jié)果顯示，實驗組與對照組RUNX3 mRNA的2-△△Ct值分別為0.53±0.02、1.00±0.00；抑制CD74可降低Capan-2細胞RUNX3蛋白與mRNA的表達量（P＜0.05，圖3）。

圖3 兩組細胞RUNX3 mRNA表達差異

2.3 免疫共沉淀法驗證CD74與RUNX3 在細胞內(nèi)相互作用

用CD74抗體與Capan-2細胞的總蛋白裂解液進行免疫共沉淀，免疫復合物經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，進一步用CD74抗體和RUNX3抗體進行Western blot分析。結(jié)果表明，Western blot能在免疫復合物中檢測到RUNX3蛋白。

繼而用RUNX3抗體與Capan-2細胞的總蛋白裂解液進行反向免疫共沉淀，免疫復合物經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，同樣用CD74抗體和RUNX3抗體進行WB分析。結(jié)果表明，WB法能在免疫復合物中檢測到CD74蛋白，Capan-2細胞株中CD74與RUNX3存在相互作用（圖4）。

圖4 免疫共沉淀結(jié)果

3 討論

胰腺癌患者預后在過去十余年間未能得到顯著改善，其診斷大多預示患者迅速痛苦的死亡發(fā)生，高侵襲轉(zhuǎn)移傾向是該疾病的特征標志[10]。近年來，有關(guān)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的遺傳和基因變化的研究取得一些進展，希望能夠在分子水平找到更好的診治胰腺癌解決辦法。目前已知CD74表達與多種惡性腫瘤進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在胰腺癌領(lǐng)域，Hustinx等[11]發(fā)現(xiàn)CD74在胰腺癌組織中高表達，Nagata等[12]認為CD74是胰腺癌的獨立預后因子。前期研究表明，CD74不但在胰腺癌組織中高表達，而且與神經(jīng)侵襲程度呈正相關(guān)；通過體外實驗抑制細胞CD74的表達，可降低細胞增殖、遷移和侵襲等能力[5-6]。上述研究結(jié)果提示CD74可能作為胰腺癌治療一個新靶點，而隨著近年Immunomedics公司研制出以CD74為靶點的人源化Milatuzumab，并和阿霉素構(gòu)成抗體偶聯(lián)藥物，使得臨床抗CD74策略治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤成為可能[13-15]。

目前，CD74在胰腺癌中是否有著與血液腫瘤相似的作用通路和機制尚未完全闡明。有研究報道CD74可作為巨噬細胞遷移抑制因子的細胞表面受體，兩者結(jié)合后誘導系列信號傳導途徑，包括CD74膜內(nèi)段切割、細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（CD74-ICD）釋放等方式發(fā)揮作用[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細胞胞內(nèi)CD74-ICD可與轉(zhuǎn)錄因子RUNX（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）相互作用，CD74活化后RUNX3水平可顯著上調(diào)，共同形成蛋白復合物，但復合物的確切功能尚不清楚，提示CD74可能作為一種新轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤細胞中發(fā)揮作用[5]。RUNX3基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新抑癌基因，Whittle等[8]發(fā)現(xiàn)RUNX3是調(diào)節(jié)胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子開關(guān)，高水平的RUNX3意味著高轉(zhuǎn)移潛能，如果RUNX3低水平，轉(zhuǎn)移風險則相對較低，有助于幫助胰腺癌臨床治療策略的選擇[18-19]；Rossi等[20]對動物模型的研究也發(fā)現(xiàn)RUNX3能夠促進PDAC轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究推測CD74在胰腺癌細胞中可能存在相似的作用機制，調(diào)節(jié)RUNX3通路進而影響侵襲和轉(zhuǎn)移，但國內(nèi)外尚未見在胰腺癌研究中有相關(guān)報道。為此，本實驗在前期構(gòu)建CD74-siRNA慢病毒載體基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染人胰腺癌Capan-2細胞抑制CD74表達，觀察CD74水平與RUNX3表達之間的關(guān)系；運用免疫共沉淀技術(shù)進一步確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用[21]。研究結(jié)果表明，與對照組相比，抑制Capan-2細胞CD74基因表達可顯著降低RUNX3蛋白和mRNA表達量，正向和反向免疫共沉淀法均證實CD74與RUNX3在Capan-2細胞內(nèi)可形成復合物，RUNX3參與調(diào)控CD74激活后人胰腺癌Capan-2細胞的生物學行為，為臨床靶向CD74治療胰腺癌提供了實驗室證據(jù)。

但CD74和RUNX3蛋白之間是緊密結(jié)合還是短暫相互作用，復合物如何調(diào)控胰腺癌細胞其他基因表達及其具體機制，尚需在后續(xù)實驗中加以完善。