黃耀星，余丹純，孫小娟，江舒曼，李偉冬，賈 林

廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510180

胰腺癌是惡性程度最高的消化系腫瘤，發(fā)病率占我國惡性腫瘤第8位，5年生存率僅為7.2%[1]。轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主因[2]，發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因及分子機(jī)制對胰腺癌的診療有著重要意義。CD74是II型跨膜糖蛋白，可在多種癌前病變和惡性腫瘤組織中表達(dá)[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道CD74與胰腺癌的預(yù)后及神經(jīng)侵襲密切相關(guān)，CD74在具高神經(jīng)侵襲轉(zhuǎn)移特性胰腺癌細(xì)胞Capan-2中高表達(dá)，降低CD74表達(dá)水平可抑制細(xì)胞的體外侵襲力[4-6]，而CD74在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚。Gil-Yarom等[7]在淋巴細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，CD74的胞內(nèi)段可能與RUNX1和RUNX3結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。目前已有報(bào)道證實(shí)RUNX3是胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子開關(guān)[8]，而胰腺癌細(xì)胞CD74內(nèi)源化后能否激活類似淋巴細(xì)胞的下游信號通路目前尚無研究報(bào)道。

為在活體胰腺癌細(xì)胞內(nèi)證實(shí)CD74與RUNX3之間的相互作用，本研究采用前期構(gòu)建的CD74-siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染Capan-2細(xì)胞，利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證CD74與RUNX3是否存在蛋白相互作用，為胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胰腺癌Capan-2細(xì)胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)）；慢病毒載體（Clonetech）、pSUPERretro-puro質(zhì)粒（Oligoengine）、Lipofectamin 2000（Invitrogen）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、293T細(xì)胞（廣州博川生物）；限制性內(nèi)切酶（NEB）；質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化）；10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；Trizol試劑盒、CD74、RUNX3引物（Invitrogen）、RT-PCR所需DNA聚合酶和Sybrgreen試劑（TaKaRa）；鼠抗人CD74和RUNX3（Abcam），羊抗鼠二抗、β-actin（Santa Cruz）；免疫共沉淀試劑盒Anti-HA Immunopreci-pitation Kit（IP 0010，Sigma）；BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒（上海博彩生物）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京普利萊）。

1.2 CD74-siRNA慢病毒載體構(gòu)建

采用課題組前期研究篩選的CD74-siRNA最佳抑制序列和慢病毒載體，酶切鑒定正確后包裝質(zhì)粒，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲并濃縮病毒上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹9]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染

人胰腺癌Capan-2細(xì)胞在含10%胎牛血清、青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取狀態(tài)良好細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿，待融合度達(dá)80%～90%時，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明操作。分為對照組（空白載體）和實(shí)驗(yàn)組（CD74-siRNA），每組按1：1000濃度加入4 μg/mL的聚凝胺，12 h后更換正常培養(yǎng)液，第2天重復(fù)進(jìn)行，共感染4次；感染結(jié)束后加入0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選陽性克隆3 d以上；每日更換培養(yǎng)液，觀察并去除死細(xì)胞，細(xì)胞長滿后凍存（P0代）并傳代，收集P2代細(xì)胞評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR

Trizol法提取兩組細(xì)胞的總RNA，測定RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，CD74、RUNX3、β-Actin等引物序列（表1）。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。讀取Ct值，以 2-△△Ct值代表各組mRNA相對表達(dá)量。

表1 引物的序列

1.5 Western blot檢測

兩組細(xì)胞在冰上操作，RIPA裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白分為2份，一份用于Western blot，另一份用于免疫共沉淀。以總蛋白20 μg進(jìn) 行 10%SDS-PAGE電 泳 ， 電 轉(zhuǎn) 膜 至 PVDF，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1：1000稀釋的鼠抗人CD74、RUNX3一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光法顯影拍照，β-actin為內(nèi)參。Image J軟件分析計(jì)算CD74、RUNX3和β-actin蛋白相對表達(dá)量。

1.6 正反向免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

按照免疫共沉淀試劑盒說明書操作。Capan-2細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解提取蛋白后，分為正向和反向免疫共沉淀組，各取裂解液分別加入1 μg的CD74抗體和RUNX3抗體，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜；將用緩沖液預(yù)處理過的10 μL HA瓊脂糖beads加入和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與HA瓊脂糖beads偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在4 ℃條件下以12 000 r/min速度離心30 s，將瓊脂糖beads離心至管底；小心吸去上清，瓊脂糖beads用1 mL裂解緩沖液洗3～4次；最后加入15～20 μL的1×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮5 min。上述樣品用10%的SDS-PAGE電泳，并進(jìn)行Western blot分析（同實(shí)驗(yàn)1.5步驟）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞CD74蛋白和mRNA表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CD74蛋白相對表達(dá)量為0.09±0.01，對照組CD74蛋白相對表達(dá)量為2.78±0.04，實(shí)驗(yàn)組CD74蛋白表達(dá)量較對照組顯著下降（P＜0.05，圖1）；qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組CD74 mRNA的2-△△Ct值分別為0.39±0.001、1.00±0.00，CD74-siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染可抑制CD74 mRNA的表達(dá)（P＜0.05，圖2）。

圖1 兩組細(xì)胞CD74和RUNX3蛋白表達(dá)差異

圖2 兩組細(xì)胞CD74 mRNA表達(dá)差異

2.2 抑制CD74對細(xì)胞RUNX3蛋白和mRNA表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)組與對照組的RUNX3相對蛋白表達(dá)量為0.006±0.0004、1.24±0.09（圖1）；qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組RUNX3 mRNA的2-△△Ct值分別為0.53±0.02、1.00±0.00；抑制CD74可降低Capan-2細(xì)胞RUNX3蛋白與mRNA的表達(dá)量（P＜0.05，圖3）。

圖3 兩組細(xì)胞RUNX3 mRNA表達(dá)差異

2.3 免疫共沉淀法驗(yàn)證CD74與RUNX3 在細(xì)胞內(nèi)相互作用

用CD74抗體與Capan-2細(xì)胞的總蛋白裂解液進(jìn)行免疫共沉淀，免疫復(fù)合物經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)一步用CD74抗體和RUNX3抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，Western blot能在免疫復(fù)合物中檢測到RUNX3蛋白。

繼而用RUNX3抗體與Capan-2細(xì)胞的總蛋白裂解液進(jìn)行反向免疫共沉淀，免疫復(fù)合物經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，同樣用CD74抗體和RUNX3抗體進(jìn)行WB分析。結(jié)果表明，WB法能在免疫復(fù)合物中檢測到CD74蛋白，Capan-2細(xì)胞株中CD74與RUNX3存在相互作用（圖4）。

圖4 免疫共沉淀結(jié)果

3 討論

胰腺癌患者預(yù)后在過去十余年間未能得到顯著改善，其診斷大多預(yù)示患者迅速痛苦的死亡發(fā)生，高侵襲轉(zhuǎn)移傾向是該疾病的特征標(biāo)志[10]。近年來，有關(guān)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的遺傳和基因變化的研究取得一些進(jìn)展，希望能夠在分子水平找到更好的診治胰腺癌解決辦法。目前已知CD74表達(dá)與多種惡性腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在胰腺癌領(lǐng)域，Hustinx等[11]發(fā)現(xiàn)CD74在胰腺癌組織中高表達(dá)，Nagata等[12]認(rèn)為CD74是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子。前期研究表明，CD74不但在胰腺癌組織中高表達(dá)，而且與神經(jīng)侵襲程度呈正相關(guān)；通過體外實(shí)驗(yàn)抑制細(xì)胞CD74的表達(dá)，可降低細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等能力[5-6]。上述研究結(jié)果提示CD74可能作為胰腺癌治療一個新靶點(diǎn)，而隨著近年Immunomedics公司研制出以CD74為靶點(diǎn)的人源化Milatuzumab，并和阿霉素構(gòu)成抗體偶聯(lián)藥物，使得臨床抗CD74策略治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤成為可能[13-15]。

目前，CD74在胰腺癌中是否有著與血液腫瘤相似的作用通路和機(jī)制尚未完全闡明。有研究報(bào)道CD74可作為巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的細(xì)胞表面受體，兩者結(jié)合后誘導(dǎo)系列信號傳導(dǎo)途徑，包括CD74膜內(nèi)段切割、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（CD74-ICD）釋放等方式發(fā)揮作用[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞胞內(nèi)CD74-ICD可與轉(zhuǎn)錄因子RUNX（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）相互作用，CD74活化后RUNX3水平可顯著上調(diào)，共同形成蛋白復(fù)合物，但復(fù)合物的確切功能尚不清楚，提示CD74可能作為一種新轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用[5]。RUNX3基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新抑癌基因，Whittle等[8]發(fā)現(xiàn)RUNX3是調(diào)節(jié)胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子開關(guān)，高水平的RUNX3意味著高轉(zhuǎn)移潛能，如果RUNX3低水平，轉(zhuǎn)移風(fēng)險則相對較低，有助于幫助胰腺癌臨床治療策略的選擇[18-19]；Rossi等[20]對動物模型的研究也發(fā)現(xiàn)RUNX3能夠促進(jìn)PDAC轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究推測CD74在胰腺癌細(xì)胞中可能存在相似的作用機(jī)制，調(diào)節(jié)RUNX3通路進(jìn)而影響侵襲和轉(zhuǎn)移，但國內(nèi)外尚未見在胰腺癌研究中有相關(guān)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建CD74-siRNA慢病毒載體基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染人胰腺癌Capan-2細(xì)胞抑制CD74表達(dá)，觀察CD74水平與RUNX3表達(dá)之間的關(guān)系；運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用[21]。研究結(jié)果表明，與對照組相比，抑制Capan-2細(xì)胞CD74基因表達(dá)可顯著降低RUNX3蛋白和mRNA表達(dá)量，正向和反向免疫共沉淀法均證實(shí)CD74與RUNX3在Capan-2細(xì)胞內(nèi)可形成復(fù)合物，RUNX3參與調(diào)控CD74激活后人胰腺癌Capan-2細(xì)胞的生物學(xué)行為，為臨床靶向CD74治療胰腺癌提供了實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

但CD74和RUNX3蛋白之間是緊密結(jié)合還是短暫相互作用，復(fù)合物如何調(diào)控胰腺癌細(xì)胞其他基因表達(dá)及其具體機(jī)制，尚需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加以完善。